| 实验步骤 | 体外Cre重组酶基因的转移和位点依赖性重组的检测材料试剂 更昔洛韦（2mmol/L;InvivoGen，sud-gcv) 小鼠：ZP3-Cre转基因鼠（Shafietal.2000) 寡核苷酸 Cre正向引物（5’-CTGCATTACCGGTCGATGCA-3’） Cre反向引物（5ACGTCCACCGGCATCAACGT-3’) 质粒DNA:pCre载体 这个载体含有一个修饰过的Cre序列，包含核定位信号和Kozak翻译保守元件；当电转化后需要产生2型等位基因结构时，可选用稍弱一些的表达载体。 方法 体外Cre基因转移以建立含有2型等位基因的胚胎干细胞亚克隆 1.在含有G418的培养液的凝胶化培养皿中培养含有F[tkneo]等位基因的亲代ES细胞，直到汇合度达到70%。 2•参照方案1中的步骤7〜13,准备电转化。 3•参照方案1中的步骤14〜16,将0.2〜2ug超螺旋形式的Cre表达载体与IXIO7个细胞混合，电转化。 超螺旋形式减小了Cre载体整合进ES细胞基因组的可能性。用少量载体可以提高产生2型等位基因的频率。 4•将细胞以不同浓度（2XIO4〜2XIO5个)铺于1〇个凝胶化的平板，培养3d。 5.在开始阴性筛选之前，换用含有2umol/L更昔洛韦的培养液，继续培养，每4〜5d更换一次培养液。 6.参照方案1步骤19〜24挑选和处理克隆。 在不含G418和更昔洛韦的培养液中培养细胞。 7•通过Southern杂交用基因组探针和ZoxP探针分析从复制平板中制备的DNA样品。 在目标载体构建过程中分别使用两个探针应该能够观察到预期的基因组片段大小I。在基因组的探针分析实验中2型等位基因经常会出现与野生型等位基因类似的或相同的迁移率。loxP探针能够区别上述两种等位基因的结构。 通过Cre^oiP重组在体内进行条件性和系统性的基因诱变 在细胞培养和选择过程中，一些ES细胞克隆无法形成嵌合体小鼠。虽然染色体分型和体外分化法对消除非整倍体和有缺陷的ES细胞克隆有很大帮助，但还是不能完全清除所有无效ES细胞克隆。含有2型等位基因的动物对用表达Cre的病毒载体进行基因诱变是很有用的。 |
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