蚂蚁淘的创始人兼CEO是钟定松先生，具有十年的从业经验，在业界享有良好的口碑； Ebiomall是跨境直采平台，我们直接从厂家采购，自己的团队负责国际物流和清关，中间没有第三方，蚂蚁淘承诺所售产品仅为正品，假一罚十。

未确认状态的订单可以修改，打开“订单详情”页面，点击右上角的“修改订单”即可，若已审核确定，则订单无法修改。

现货产品付款审核后即可发货,大部分期货产品在3周左右即可到货,提供时必达服务的产品订单审核十天内即可发货。

如订单处于未确定状态，进入“我的订单"页面，找到要取消的订单，点击“取消订单”按钮。

本网站所售商品都是正规清关，均开具13%正规发票，发票金额含配送费金额，另有说明的除外。

蚂蚁淘任何页面都有在线咨询功能，点击“联系客服”、“咨询”或“在线咨询”按钮，均可咨询蚂蚁淘在线客服人员， 或拨打4000-520-616，除此之外客户可在 联系我们页面找到更多的联系方式。

同个订单购买多个商品可能会分为一个以上包裹发出，可能不会同时送达，建议查看订单详情是否是部分发货状态；如未收到，可联系在线客服或者致电4000-520-616。

一般情况下，退货处理周期为客户收到产品一个月内（以快递公司显示签收时间为准），包装规格、数量、品种不符，外观毁损、短缺或缺陷，请在收到货24小时内申请退换货；特殊商品以合同条款为准。

希望可以官方一点，科学一点，如果有ppt是最好，深入浅出，如果有具体例子最好

由于实验需要，想要求助带Hygro（+）筛选标记的真核表达载体，我们实验室有原核pET22b,pET28a,真核pCDNA3.1,pCDNA6，PEE12.4，,pICZa-A（酵母），还有HEK293，293F悬浮，CHO-K1，CHO-S等各种真核表达体系细胞以及各种肿瘤细胞，希望站友鼎力相助，跪谢

近年来的研究发现，一些小的双链RNA可以通过促使mRNA降解，高效、特异的阻断体内特定基因表达。称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。由于RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。为此被Science评为2001年最重要成果之一。RNAi，即引入双链RNA，通过特异性结合互补链从而抑制基因表达/引发转录后沉默。许多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究基因功能。较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs通过化学方法合成。进一步的，开始有了商业化的体外转录方法合成siRNA的试剂盒提供，比化学合成方法经济。现在已有研究小组开发表达载体，能够在哺乳动物细胞中持续表达siRNAs。Stratagene的新产品GeneEraser™ shRNA expression vector，可以表达shRNA，在体内加工后形成类似siRNAs的分子，能够引发RNAi过程。

请问pSilencer和pSUPER干扰载体（普通的质粒，不是腺病毒或慢病毒）转染动物细胞后，质粒能够整合到染色体上吗？
若不整合，干扰效果能稳定持续多长时间啊？
细胞会不会最终把游离的质粒摔掉？

请教一下，一般做启动子报告基因检测，载体用pGL3,pGL4双荧光报告基因质粒，但pGL3,pGL4都只能做瞬时转染，我的细胞（不想用293做实验）质粒转染后都会死很多，还要加上一些处理因素（比如药物，饥饿等），细胞状态更不好了。所以想找一个慢病毒骨架的报告基因质粒。

上网查了下，SBI的pGreenFire1和Genecopia的Gluc-ON是慢病毒质粒。

1.pGreenFire1可以检测Luc和GFP，但用什么做内参呢？查了下文章，有的文章检测Luc的时候同时检测一个MTS读数做内参；另外有一篇文章用qPCR的方法检测了GFP和GAPDH，用GAPDH做内参。不确定这样是不是正确呢？

2.Gluc-ON检测的是分泌型的Gluc，载体上还有分泌型的碱性磷酸酶做内参。

不知有没有哪位以前用过这两个质粒的？文章用这两个质粒的都不多，不知投稿的时候会不会被质疑？

免疫沉淀
当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。
Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。生物通
整个过程大致如下：
1. 创建miRNA模拟物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞，并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物（其中包括靶标mRNA）进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA，鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文库让研究人员能够在实验室内开展全转录组范围的miRNA和ncRNA靶基因鉴定。它是个全转录组范围的cDNA文库。在文库转染和选择之后，细胞被已知miRNA转染。对于那些包含与miRNA相互作用的cDNA的细胞，它们将生存到第二轮。那些选择出的cDNA可通过测序来鉴定。这样，研究人员只需投入很少，就能实现大范围的筛选。
靶基因的验证
预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。首先，构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR插入荧光素酶基因的3’UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，并改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
目前有多家公司提供荧光素酶报告载体或构建服务。Promega就提供pmirGLO双荧光素酶表达载体。它采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶这两种报告基因，其中萤火虫荧光素酶（luc2）作为主要报告基因，其表达减少意味着内源性的或外源引入的miRNA 与克隆的miRNA 的靶序列发生了结合；海肾荧光素酶/新霉素基因（hRluc-neo）作为对照报告基因，既能实现归一化处理，又能筛选稳定转染的细胞系。这样就以一个载体实现了以往两个载体的功能。
就目前而言，预测和鉴定miRNA靶基因的方法虽然不少，但仍然没有一种常规方法。随着计算机算法的不断改进和生物学技术的快速发展，这种现状有望改变。让我们拭目以待吧。（生物通 余亮）

siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。
RNA干扰主体实验的重点在于： 按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：
⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
⒉nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
⒊positive siRNA对照（监控假阴性）；
⒋技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
⒌rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。
实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选5，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”， 一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。
mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化；细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证（体内）　动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低，所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。向左转|向右转

质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等（见后）。
人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要向左转|向右转

目前，最主流的腺病毒载体系统有Adeasy系统和AdMax系统。
Adeasy系统：通过原核重组极大提高了腺病毒的重组效率。其具体的构建步骤如下图。
AdMax系统：Cre/LoxP体系改造后的真核腺病毒包装体系，进一步增加的操作的便捷，同时滴度较Adeasy有进一步提高。步骤如图所示。
下面是一些经典的AdMax系统质粒图谱：

生物发光，是生物素酶

世界上第一支病毒载体的基因治疗抗肿瘤药物是由哪个公司研发生产的

目的基因启动子能启动报告基因
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合,从而起始基因转录的一段DNA序列,通常位于基因上游.一个典型的启 动子包括CAAT-box和TATA-box,它们分别依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点,一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核心启动子上 游通常会有一些特殊的DNA序列,即顺式作用元件,转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录.一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可 启动基因转录,因此启动子是基因表达调控的重要元件,它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质.
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子.