PlasmidInfo:
PlasmidInformation
ProductName:pSF-CMV-Puro-NH2-6His-KrYFP-Thr
ProductCode:OG1311
Size(bp):6890bp
BacterialAntibioticSelection:KanR
OriginandCompatibility:pUChighcopyderivedfrompBR322
BacterialCopyNumber:500-700percell
Promoter:Cytomegalovirus(CMV)immediateearlypromoter/HumanUbiquitinPromoter
PlasmidPurpose:
Thisplasmidisdesignedtoexpresstaggedproteinsinmammaliancellseitherbytransienttransfectionorbycreatingstablecelllines.ItcontainsapuromycinresistanceexpressioncassetteusingthehumanUbiquitinpromotertodriveexpressionandallowfortheselectionofcellscontainingtheplasmid.
AbouttheCleavageTag:Thisplasmidalsoencodesaproteasecleavagesitethatisdesignedtobepositionedbetweenyourgeneofinterestandthetagtoallowtheremovalofthetagfollowingproteinpurificationorisolation.ThisplasmidcontainsaThrombincleavagetag.Theproteinsequenceofthecleavagetagis:LVPR?GS.ItcleavespreferentiallybetweentheArgandGlyresidues.Offtargetcleavagecanoftenoccuratnon-specificsitesnormallyfromothercontaminatingproteases.Toensuremaximalproteinintegritytheenzymereagentmustbehighlypure.
Formoreinformationonwhichcleavagetagtouseseeourcleavagetagguide.
PromoterExpressionLevel:ThisplasmidcontainsthemammalianCMVpromotertodrivegeneexpression.WehavetestedallofourmammalianpromotersinarangeofcelltypesandCMVisconsistentlythestrongestinthosewehavestudied.HowevertherearemanyreportsoftheCMVpromoterdemonstratingsilencingbymethylationinlong-termculture.ForthisreasonwestockarangeofotherpromotersthatarecompatIBLewiththisplasmidandareavailableonrequest.
Thisplasmidcontainsann-terminalnon-aequoreabasedyellowfluorescentprotein(KrYFP)reportertagthatcanbefusedtoageneofinteresttoallowproteindetection.
ThisplasmidalsocontainsasecondaryHexa-Histidine(6His)proteintag.Thesequenceofthistagis:HHHHHH
Weprovidearangeofdualpeptidetagplasmids.ThisisbecausesomepeptidetagsprovidespecificBIOLOGicalproperties(e.gsmallmoleculeaffinitynewepitopessolubilityorproteinsecretion)thatarenotprovidedbyothers.
SequenceandMap:
OtherInfo:
TranscriptionTermination:Thisplasmidcontainsthreealternativetranscriptionterminatorsformammalianbacterialandbacteriophage(T7)expression.Thismeansthatonlythepromoterneedstobechangedtoaltertheexpressionsystemyouareusing.Wesellmultiplepromotersthatcanbeusedineachofthesesystems.Thepresenceofeachterminatordoesnotreduceexpressioninthealternativesystems.
Cloning:
MakingProteinFusions:ThisplasmidhasbeendesignedtoallowthreetypesofcloningintothemainMCStojoinacodingsequencewiththetag.
1:SnapFusionCloning:IfyouwouldliketofuseyourcodingsequencetothetagwithminimaladditionalbasesyoucanuseourSnapFusiontechnology.ThisprocessinvolvesamplifyingyourgenebyPCRtoaddspecificrestrictionsitesontotheends.WhenthesesitesarecuttheyproduceanoverhangthatiscompatiblewiththisplasmidcutwithBseRIorBsgI.
Toinsertyourgene:
1:Amplifyyourgenewithprimersdesignedusingthisspreadsheet
2:CuttheplasmidwitheitherBseRIorBsgI.*
3:Cutyourgenewiththeenzymeyouaddedusingthespreadsheet(anyofAcuIBpmIBpuEIBseRIBsgIEciI).
4:ClonethegeneintotheplasmidusingDNAligase.
UsingthismethodwithanN-terminaltagplasmidwillresultinthetagcodingsequenceimmediatelyfollowedbyyourgenesATGstartcodonatthejoin.Thisresultsinaseamlessfusionofthetwosequenceswithnoextrabasesbeingadded.UsingthismethodonC-terminaltagplasmidswillconvertyourgenesstopcodonintoaTAC(TyrY)codonfollowedbytheplasmidtagcodingsequence.Thisresultsinnoextrabasesbetweenyourgeneandthetag.Seethediagrambelowformoreinformation.
*PleasenotethatinsectexpressionplasmidscannotbecutwithBsgIonlyBseRIbecauseofunavoidableconflictingsitesinthebackbone.AlsoYeastplasmidscannotbecutwithBseRIbecauseofunavoidablerestrictionsitesinthebackbone.
Usingthistechniquewillcreateagenefragmentthatcanbeligatedintoanyorour>1500peptideandreportertagplasmids.Ifyouuseoneoftheothertechniquesbelow(GibsonInFusionSeamlessorLIC)youwillneednewprimersforeveryvectoryoucloneintobecausethearmsofhomologywillchangeaccordingtothetagplasmidyouarecloninginto.
Ifyoufindthatyourgenesequencehassitesinitthatmakeusingthiscloningstrategydifficultyoucanstilluseoneofthealternativemethodsbelow(e.g.standardcloningorGibsoncloning).
OpenthePrimerDesignTooltohelpyoudesignprimersforcloningyourgeneinourSnapFusiontechnique.
2:StandardEnzymes:Ifyouarenotconcernedaboutleavingafewextrabasesbetweenthetagcodingsequenceandyourgeneyoucancloneyourgeneintothevectorusingstandardcloningrestrictionenzymes.Thisstrategywillrequireyoutochoosewhichenzymesyouwanttousetocloneyourgene.
OpenthePrimerDesignToolwhichprovidesprimerswithdifferentenzymechoicespositioningyourgeneasclosetothetagaspossibleineachcase.Pleasenotethatstandardenzymeswillalwaysleaveadditionalnucleotidesbetweenyourgeneandthetagbutusingthespreadsheetwillensurethetagandgeneareinframe.
3:Gibsoncloning/InfusionHD/GeneArtSeamless/LigaseIndependentCloning(LIC)Methods:ThesecloningtechniquesusereagentssoldbyothercompaniesandallowyoutofusesequencestogetherusingenzymesthatchewbacktheDNAtoleaveoverlappingends/overhangs.ThesubsequentmethodofjoiningtheDNAdependsonthekitused.Touseoneofthesetechniquesyoucaneitherdesignyourownprimersoryoucanusethespreadsheetbelowtohelpwiththedesign.
OpenthePrimerDesignTooltohelpyoudesignprimersforcloningyourgeneusingGibsonassemblyInfusionHDGeneArtSeamlesscloningorLigaseIndependentCloning(LIC)techniques.
IPStatus:
IntellectualPropertyStatusThisproductispartofourSnapFastplasmidrange,formoreinformationontheIntellectualpropertystatusofthisplasmidpleaseclickhere
ebiomall.com
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请教一下，一般做启动子报告基因检测，载体用pGL3,pGL4双荧光报告基因质粒，但pGL3,pGL4都只能做瞬时转染，我的细胞（不想用293做实验）质粒转染后都会死很多，还要加上一些处理因素（比如药物，饥饿等），细胞状态更不好了。所以想找一个慢病毒骨架的报告基因质粒。
上网查了下，SBI的pGreenFire1和Genecopia的Gluc-ON是慢病毒质粒。
1.pGreenFire1可以检测Luc和GFP，但用什么做内参呢？查了下文章，有的文章检测Luc的时候同时检测一个MTS读数做内参；另外有一篇文章用qPCR的方法检测了GFP和GAPDH，用GAPDH做内参。不确定这样是不是正确呢？
2.Gluc-ON检测的是分泌型的Gluc，载体上还有分泌型的碱性磷酸酶做内参。
不知有没有哪位以前用过这两个质粒的？文章用这两个质粒的都不多，不知投稿的时候会不会被质疑？
2、人体病灶细胞或者分泌型细胞有载体病毒受体；
3、DNA病毒，且酶切改造后具有复制能力；
4、表达产物对载体病毒没有抑制作用。
不知道是否准确，希望对你有帮助。
2、基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用．（2）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
②启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始，故②正确；
③终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束，故③正确；
④由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，
常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端(多为黏性末端，也有平末端)，采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
Adeasy系统：通过原核重组极大提高了腺病毒的重组效率。其具体的构建步骤如下图。
AdMax系统：Cre/LoxP体系改造后的真核腺病毒包装体系，进一步增加的操作的便捷，同时滴度较Adeasy有进一步提高。步骤如图所示。
下面是一些经典的AdMax系统质粒图谱：
完整的表达载体必须包括：
1、复制子,在细菌中扩增时所必须.
2、启动子,目的基因在细菌或细胞中转录所必须,转录了才能翻译,是谓“表达”.
3、原核筛选标记,细菌增菌所必须.
4、真核筛选标记,如果是真核表达,就是必须的.
5、多克隆位点,即酶切位点,插入目的片段的区域.
6、其他所需构件,可视实验设计情况而选用现成载体或在载体上自行添加.
另：表达的起始和终止,在目的基因上附带起始密码子和终止密码子.
在把目的基因两翼的序列克隆到载体上的时候，两端序列的方向是必须与染色体的方向一致吗？如果一正一反，或者是两者都反向可以敲除吗？谢谢！
常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
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