| 实验步骤 | 被感染昆虫细胞表面展示的病毒蛋白质的免疫荧光分析材料试剂 焚光接合的二抗（如AlexaFluorDyes;Invitrogen) 杆状病毒：重组展示和野生型 DABCO(25mg/ml溶于Mowiol中，Sigma-Aldrich) 昆虫细胞生长培养基（无血清） Mowiol(Calbiochem) 4%多聚甲醛（溶于PBS) spodopterafrugiperda(S/9)细胞株（ATCC，CRL-1711) 悬浮生长的细胞在转染时细胞密度大约为2XIO6个/ml。 TritonX-100 仪器 细胞培养箱（如用于悬浮细胞培养的旋转培养瓶) 盖玻片 小型离心机 显微镜载片 方法 1.用重组和野生型病毒（对照）感染约IOml的Sf9细胞，感染复数（moi)为5〜10。 于28°C旋转摇床转速125r/min培养24〜28h。 2.从每个感染组中收取〇.5〜lml细胞（1X1〇6个或2X1〇6个），于4°C，2〇〇〇r/min 3.吸去培养基，用〇•5〜1ml预冷的PBS、心重悬细胞。 4•于4°C，2000r/min离心3〜4min，吸去培养基。 5.可选步骤，细胞可以经过固定和（或）封闭和渗透处理。 a.〇.5〜Iml4%多聚甲醒孵育。 b.4°C振荡20min。 c.于4°C,2000r/min离心3〜4min,吸去固定剂。 作为选择，免疫标记后可以对样品进行固定（步骤10后）。如果展示的蛋白质具有荧光，则直接进行步骤11 d.室温下，用0.1%TritonX-100-BSA封闭和渗透细胞lOmin。 6.用PBS稀释的一抗孵育细胞，4°C振荡lh。 7.4°0,0.5——11111?63振荡洗涤细胞三次，每次15min。在每次洗涤细胞后2000r/min,4℃离心3min。 8•加人适量PBS稀释的荧光标记的二抗，4°C避光振荡孵育30min。 每1x106——2x106个细胞大约用200ul。 9.4℃，0.5〜1mlPBS振荡洗涤细胞三次，每次15min。在每次洗涤细胞后2000r/min,4°C离心3min。 10.吸去上清，用30〜50filDABCO重悬细胞。 11.将几微升的细胞悬液转移到载玻片，盖上盖玻片，干燥，暗处4°C保存。因为在操作过程中细胞数量会减少20%〜50%，根据最后的细胞数量调整DABCO的体积。 12.用普通荧光显微镜或者是激光共聚焦显微镜分析细胞。 |
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