Plasmid Info:
Plasmid Information
Product Name: pSF-OXB17
Product Code: OG560
Size (bp): 3858 bp
Bacterial Antibiotic Selection: KanR
Origin and Compatibility: pUC high copy derived from pBR322
Bacterial Copy Number: 500-700 per cell
Promoter: OXB17 bacterial promoter
Plasmid Purpose:
This is a strong prokaryotic promoter for the production of proteins in E.coli. It was created by modifiying the RecA E.coli promoter to remove the LexA repressor site followed by random mutagensis to reduce expression. In our range of non-inducible promoters this is one of the strongest. Only OXB18 OXB19 and OXB20 are stronger whilst OXB1-OXB16 are weaker.
Promoter Expression Level:This plasmid contains a very strong constitutive E.coli promoter that was derived from the RecA promoter by random mutagenesis. It is part of our constitutive bacterial promoter range. This promoter (OXB17) shows the very high levels of expression in the range with OXB1 showing the lowest level and OXB20 showing the highest level of expression. They require no inducing agent for expression.
Sequence and Map:
Other Info:
Transcription Termination:This plasmid contains three alternative transcription terminators for mammalian bacterial and bacteriophage (T7) expression. This means that only the promoter needs to be changed to alter the expression system you are using. We sell multiple promoters that can be used in each of these systems. The presence of each terminator does not reduce expression in the alternative systems.
Cloning:
Cloning in a Gene:This plasmid has been designed to be compatible with a range of cloning techniques. The multiple cloning site contains a range of standard commonly used restriction sites for cloning. Using these sites genes can be inserted using standard cloning methods with DNA ligase. Other methods such as ligase independent cloning (LIC) Gibson Assembly InFusionHD or Seamless GeneArt can also be used and because all of our plasmids are based on the same backbone the same method can be used for cloning into all of our catalogue vectors.
Multiple cloning site notes:There are a few important sites within the MCS. These include the NcoI site the XbaI site and the BsgI and BseRI sites. The NcoI site contains a start codon that is immediately downstream of both a Kozak and Shine-Dalgarno ribosomal binding site. These allow for optimal positioning of genes when the start codon is placed in this location. If this is not required and you wish to use a downstream site for gene cloning you can remove the NcoI site by cleaving the plasmid with KpnI.
The XbaI site contains a stop codon. This stop codon is positioned in a specific position in relation to the BsgI and BseRI sites that are immediately downstream. When either BseRI or BsgI cleave the plasmid they produce a TA overhang from the stop codon in the XbaI site that is compatible with all of our peptide tag plasmids cut with the same sites. BseRI and BsgI sites are non-palindromic and cleave a defined number of bases away from their binding site.
Whenever we clone a gene into our multiple cloning site we always position the start and stop codon in the same positions in the MCS. If the start and ends of the genes are not compatible with NcoI and XbaI we extend the sequence to the nearest external sites but keep the start and stop codons locations consistent.
IP Status:
Intellectual Property StatusThis product is part of our SnapFast plasmid range, for more information on the Intellectual property status of this plasmid please click here
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在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子，双子叶植 物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子，它具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游-343～-46bp是转录增强区 ，-343～-208和-208～-90bp是转录激活区，-90～-46bp是进一步增强转录活性的区域，在了解CaMV 35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人 们利用它的核心序列构建人工启动子，以得到转录活性更高的启动子，Mitsuhara等利用CaMv 35s核心启动子与CaMV 35S启动子的5‘端不同区段 和烟草花叶病毒的5’非转录区（omega序列）相连，发现把两个CaMV 35S启动子-419～-90（E12）序列与omega序列串联，在转基因烟草中GUS有 最大的表达活性，把7个CaMV35S启动子的-290～-90（E7）序列与omega序列串联，非常适合驱动外源基因在水稻中的表达。用这两种结构驱动 GUS基因表达，在转基因烟草和水稻中GUS活性比单用CaMV 35S启动子高20～70倍。
另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒（cassava vein mosaic virus ）中分离的。该启动子 -222～-173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中表达，其中-219/-203是TGACG重复基序，即as1 （activating sequence 1），-183/-180为 GATA（又称为as2），这两个元件的互作对控制基因在绿色组织中表达至关重要。该启动子-178～-63bp包含负责调控基因在维管组织中表达的 元件。CsVMV启动子在转基因葡萄中驱动外源基因的转录能力与使用两个串联的CaMV35S启动子相当，两个串联的CsVMV启动子转录活性更强。 Rance等利用CoYMV（commelina yellow mosaic virus），CsVMV启动子区和CaMV 35S启动子的激活序列（as1，as2）人工构建高效融合启动子，瞬 时表达实验表明该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草中高效表达，在单子叶植物玉米中其驱动能力比通常使用的γ玉米蛋白启动子高6倍。因此用这种人工构建的高效 启动子驱动抗病基因或目的蛋白基因，在双子叶和单子叶植物中均可达到较理想的效果。
人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子，并初见成效，例如肌动蛋白（actin）和泛素（ubiquitin）等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β 亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。
由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在 整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻 碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。因此， 人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。
②组织特异启动子（tissue-specific promoter）又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白（leguimin）基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白（patatin）基因启动子在块茎中优势表达。
2.1根特异启动子
根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及其启动子无疑是重要的。拟南芥根中特异表达的黑芥子酶（myrosinase）是由Pyk10基因编码的。Pyk10启动子中存在若干器官特异性表达和 植物激素应答的特异元件，如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、诱导物（elicitor）应答元件W-box（（T）TGAC（C））、植物激素应答 元件（如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件）和细胞特异表达元件等。其中ACGT，CANNTG，GATA等顺式作用元件是决定组织器官特异 表达的转录因子结合位点，Myb元件在控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用。
根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等问题。BoriSjuk等用根特异启动 子mas2‘，GFP和烟草钙网蛋白（calreticulin）基因构建融合表达载体，水培转基因烟草结果表明，根细胞不仅能够高效生产GFP，而且可将目的 蛋白质分泌到液体培养基中。因此利用该启动子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合，不仅可大量生产目的蛋白质，且更便于回收产物。
2.2 茎特异启动子
Trindade等利用cDNA-AFLP技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511（transcript derived fragment），其基因Stgan可能参与植物体内影响赤霉素水平的复合物的合成。在NCBI数据库中，比较Stgan启动子与马铃薯的patatin Ⅰ和Ⅱ、 蛋白酶抑制子、nodulin 22K和23K等编码蛋白质基因的启动子，发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列；该启动子还包含植物 中几个保守的转录因子（如Dof1，Dof2，Dof3和PBF）的结合位点。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子 驱动基因在茎结节处特异表达，可能参与块茎形成过程。
研究在茎中特异表达基因的启动子，不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程，更重要的是利用这些启动子调 节植物代谢可满足人类需求，如人们对木质素生物合成及其调控的研究。木质素是植物体内仅次于纤维素的一种含量丰富而重要的有机大分子 物质，它的存在对于增加植物机械强度、远距离水分运输和抵抗外界不良环境的侵袭都是非常有益的。然而，木质素的存在也有一定的负面作 用。因此，人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量。目前多使用CaMV35S启动子驱动目的基因，近年来已分离一些木质素生物合成途径中 关键酶基因的启动子，如4CL，F5H等基因的启动子，人们正在尝试利用这些特异性启动子来调节木质素的生物合成。Bell-Lelong等已从拟南芥 中分离了肉桂酸羟-4-基化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）基因的启动子，本实验室首次从毛白杨中分离了C4H启动子，并对该启动子的功 能进行了初步鉴定。GUS组织化学染色和GUS荧光测定结果表明。G4H启动子驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达，有望将来利用该启动 子驱动功能基因调控木质素的生物合成过程。
2.3 叶特异启动子
Marraccini等从咖啡（coffea arabica）中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（rubisco）小亚基基因RBCS1， 该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达。研究发现RBCS1启动子上游GTGGTTAAT序列与豌豆RBCS3A启动子的BoxⅡ核心序列相同；在其启动子G -box（GCCACGTGGC）两侧分别有一个类I-box（核心序列为GATAAG），形成I-G-I结构，推测G-box十个碱基的回文结构可能结合某个转录因子；其AT-1 box（AGAATTTTTATT） 与其他RBCS和CAB基因的AT-1 box（AATATTTTTATT）相比只有两个碱基不同；类L-box（AAAATTAACCAA）与马铃薯RBCS1和RBCS3A启动子的相同。由此 可见，植物叶特异表达顺式元件具高度保守性。
有趣的是Taniguchi等在玉米中发现了一个双元启动子系统（dual promoter system）。PPDK（pyruvate， orthophosphate dikinase）是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶，该酶基因Pdk具有一个双元启动子系统（C4Pdk启动子和细胞质Pdk启动子）。这 两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异，C4Pdk启动子驱动Pdk转录成较长的mRNA。基因产物定位在叶绿体中；细胞质Pdk启动子在 Pdk基因的第一个内含子中，驱动Pdk转录成较短的mRNA，它所编码的蛋白质定位于细胞质中，又称为细胞质Pdk启动子。C4Pdk启动子是受光诱 导的强启动子，驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达；而细胞质Pdk启动子是个弱启动子，且不具有组织特异性。大多数C4植物的光合作用相关 基因的表达具有细胞特异性，且主要在转录水平调节基因表达活性，因此，可利用该启动子在C4植物叶肉细胞中高效表达外源基因。
翻译结果：
Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
稳定转染hif-1α rna干扰表达载体_有道翻译
翻译结果：
Alpha stable transfection hif - 1 RNA interference expression vector
①动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子.
②有许多种动物病毒,在其感染周期中都能够持续地复制,使其基因组拷贝数达到相当高的水平.
③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子.
④有些动物病毒,在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上.
⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor).用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions),即构成了一种高效的转化体系.
(forced expression)或过表达(overexpression),以观察基因表型,反义则是用来抑制基因表达,以观察在目的基因的表达受到抑制的情况下表型的变化
首先需要构建dsRNA表达载体
将这种载体导入受体细胞中后
表达产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA
引起具有相同序列的mRNA发生讲解
导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质
所以个体会表现出功能缺失表型
构建表达载体通常选用dsRNA
需要注意的一些方面是
dsRNA序列中GC的含量要小于50%
高GC含量会降低RNAi的效果
选定的dsRNA序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性
以避免对其他同源性基因表达的抑制
不同区域的dsRNA具有不同的基因沉默效果
可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体
还要充分考虑siRNA的结构特征
siRNA与mRNA的同源程度对RNAi有明显影响
启动子区或者编码区与siRNA同源的基因受siRNA抑制
但siRNA在动物细胞中对mRNA的前体没有影响
所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi
而且在构建表达载体时
经常使用U6启动子等RNA聚合酶Ⅲ能够识别的启动子序列
最后将其转入到质粒中
这里说的只是一个简单的过程
总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程
如果要知道详细的技术
建议还是去看书吧
这里是说不清的
一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。
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