
CD244 (2B4, SLAMF4) is a 66 kD member of the CD2/SLAM related receptor family (SRR). It is expressed on NK (3), Tcell subsets, monocytes and eosinophils(4). It is expressed at high levels on Leuikemia initiating cells, and plays a role in their proliferative potential (5). In mice there are two transcription variants, a long form and a short form of CD244 each of which have distinct signaling properties. In humans, only the long form is expressed. Decreased CD244 expression on monocytes of SLE patients correlated (negatively) with autoantibody titer(2). CD244 mediated function in immune response can vary greatly dependant on the context of its ligation.
Antibody ANC244.8 binds to recombinant CD244-muIg (cat #544-020) in EIA, and to cell surface CD244 on human PBL in FACS. ANC244.8 binds to a CD244 epitope that is distinct from the binding sites of clone ANC244.3 (cat #259-020). It blocks binding of clone C1.7.
References:
1) Boles KS, Mathew PA, et al. (1999) Tissue Antigens 54(1): 27-34.
2) Mak A, AM Fairhurst, et al. (2017) Clinical Rheumatology 37(3): 811-816. doi.org/10.1007/s10067-017-3698-2.
3) Vacca P, MC Mingarri, et al. (2006) Blood 108: 4078-4085.
4) Munitz A, Levi-Schaffer F, et al. (2005) J Immunol 174(1): 110-118.
5) Zhang F, Zheng J, et al. (2017) Haematologica Doi: 10.3324/haematol.2016.151555.
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这个是用于代理授权的,这个可以说是唯一辨别产品真伪的方法,
有证书的企业,销售的产品可信度比较高。
目的片段用kpn1和xho1双酶切,然后连接到PGL4.10上,结果用RPV3测序出来目的序列是反向互补的,这是什么原因导致的?
以这些标准看,目前的基因组测序结果,还没有一个是完美的。
人类基因组:缺点在哪里?
首先,人类基因组还不够精确。人是“二倍体”,也就是有一半遗传物质来自父亲,一半遗传物质来自母亲,且在受精卵形成过程中,还会发生基因重组,这是人类遗传多样性的来源之一。科学家们需要更精确的“单倍型”数据,这样基因组才够“完美”,而这种“完美”正是研究者们追求的目标。
其次,人类基因组还不够多元。
按照传统的人种分类,人类按照肤色黑白黄棕,被粗分为四大类:尼格罗人种、高加索人种、蒙古人种、澳大利亚人种。基因组测序数据是从高加索人种开始的,人类基因组计划是人类的标准参考基因组,也是高加索人种的标准参考基因组。文特尔的基因组,测序对象是他自己,同样是高加索人种。
然而,从基因组研究的角度,为了尽可能地包括各种遗传背景,需要为更多族裔建立自己的参考基因组。
资料来源:http://www.mv163.cn/jkgl/news/2015/1224/5227.html
【之前构建的4个重组质粒里也有两个出现这样的问题(aagtcc变成agtcc),但是酶切能切出插入的片段】
目前问测序公司得到的答复是样品可能不是单克隆,测序结果是不准确的,建议重新挑取单克隆测序。
不知道还有没有别的方法?
二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变,而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。本文对二代测序领域的最新进展做了小结,其涉及的公司包括454LifeSciences,Illumina,LifeTechnologies,PacificBiosciences,OxfordNanopore等。
自从哈佛大学遗传学家GeorgeChurch和454LifeSciences公司JonathanRothberg掀起二代测序NGS的**以来,已经过去了将近十年。毫不夸张地说,这段时间以来NGS技术已经发生了翻天覆地的变化,在测序通量突飞猛进的同时,测序成本直线下降。
想当年454LifeSciences公司测序580-kb的细菌基因组,需要四小时的工作循环。而今年一月份Illumina公司发布的HiSeqX?Ten测序系统,能够以千元成本测序完整的人类基因组,最多每天能测序600billionbp。
如今,二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此,基因组学ArchonX奖(ArchonGenomicsXPrize)不得不于去年八月宣布取消,因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。
Church的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一,他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何,既然竞赛已经启动,总得让人家比完吧。
言归正传,二代测序领域的2013年既忙碌又喧嚣,在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。
454LifeSciences
去年十月,454LifeSciences宣布将于2016年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器,GSJunior和GSFLX+。据该公司介绍,从扩展性和成本角度看,454平台作为首个商业化的NGS系统已经基本上走到尽头,很难再对其进行升级和改良。Roche的BethButton指出,公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013年9月,该公司宣布与昔日的竞争对手PacificBiosciences合作,拟基于PacBio公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。
Illumina
今年一月Illumina公司发布了两个以Solexa测序技术为基础的新测序平台,HiSeqXTen和NextSeq?500。
据该公司的新闻稿介绍,定价$250,000的台式NextSeq500兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作,可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组。”NextSeq500运行75个测序循环只需12小时。
HiSeqXTen系统以10台仪器为单位销售,据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价1000万美元,能够在三天时间内生成1.8terabases的数据,相当于每天约600Gb,比HiSeq2500强十倍。
华盛顿大学的ElaineMardis表示,HiSeqXTen系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业,因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本,就需要正确的样本量,”她说。当然,高通量还意味着更为复杂的数据分析。
Mardis的团队曾作过计算,为了跟上HiSeqXTen他们可能需要花费八百万美元在信息学设施上。此外,实现千元成本意味着每年需要测序18,000到20,000个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组,”她说。“但数量还远远不够。”
LifeTechnologies
已被ThermoFisher收购的LifeTechnologies拥有两款NGS平台,SOLiD和IonTorrent。据Thermo的AndyFelton介绍,公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到Ion上,”他说。
目前的IonPGM系统可使用最新的Ion318芯片,产出多达6million400bp的读取,也就是说四小时运行的产量能达到2Gb。而新IonProton?使用IonPI?芯片,能够产出80million200bp的读取,即每次运行产量达到10Gb至14Gb。
据介绍,今年公司将会推出用于转录组测序的新IonPII芯片,每张这样的芯片可产出300million100bp的读取,随着系统改良甚至可能达到200bp。
此外,LifeTechnologies公司正在研发一种新的聚合酶,Hi-Q。据Felton介绍,Hi-Q能“显著提高精确性”,减少90%的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化。
PacificBiosciences
PacificBiosciences公司以长读取的二代测序技术著称。据该公司的创始人SteveTurner介绍,在新测序化学P5-C3的帮助下,如今PacificBio的测序读长已经达到了8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”,可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触,避免酶受到潜在的光学损伤。
“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤,我们相信现在测序读长受到的限制,只来自于样品本身,”Turner说。样品本身的限制是指,读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板,而这样的缺口会导致测序过早中止。
目前PacBio®RSII和SMRTCell系统,每次运行可产出50,000个读取(约400millionbp)。这一数字会在接下来的一年中继续增涨,Turner说。“我们预计在2014年内,令测序读长再增加50%,并于2015年达到20,000bp。”
最近研究人员发表文章向人们展示,在新装配方法HGAP的帮助下(hierarchicalgenome-assemblyprocess),可以实现只利用PacBio化学法对真核基因组进行从头装配。一月份,该公司公布了对黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)进行的完整二倍体基因组装配,生成了长达24.6Mb的重叠群(contigs),N50值为15.2Mb(N50值反映了重叠群的长度)。就在上周,PacBio公司又公布了一个54x覆盖度的单倍体人类基因组装配,生成了“3.25Gb的基因组装配,重叠群N50值为4.38Mb,其中最长的重叠群达到44Mb。”
OxfordNanopore
OxfordNanopore公司无疑是纳米孔测序的领导者,这一技术也被称为第三代测序。该公司去年十月份宣布,将在2014年年初推出USB大小的MinION?测序仪,为客户提供先期体验(early-access)。
与其他类似先期体验项目不同的是,OxfordNanopore公司不会局限于传统的测序中心,而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。
OxfordNanopore公司强调,不是每个MinIONAccessProgram(MAP)申请者都会在第一轮受到邀请,而且公司提供的MinION数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。
2012年,OxfordNanopore公司在AGBT上描述了两个测序系统,MinION就是其中之一,另一个产品是GridION?。据公司发言人称,MinION的大小使其更容易受到人们的关注,它的灵活性和测序能力将推动NGS进一步迈向普罗大众。
OxfordNanopore公司希望通过MinIONAccessProgram评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的GridION先期体验项目,不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。
广泛的应用前景
在二代测序技术不断进步的同时,它的应用也越来越广泛。据Mardis介绍,二代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择二代测序的多基因panel对肿瘤进行研究,或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时,人们也逐渐抛开了传统的诊断方法,转而使用全外显子组测序。
Mardis补充到,NGS检测有两大优势,它既可以帮助人们确定治疗方案,也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上Church认为,用二代测序进行(致病基因)携带者筛查,是NGS的“杀手锏”。
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因,”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因,现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。”
最近,Church作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍,这是首次发表用NGS进行携带者筛查的文章,他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针,在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因,其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。
二代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞RNA测序。“单细胞RNA测序能向我们展示,相同细胞中RNA表达的天然随机性,这一点非常吸引人。”Mardis说。
Church介绍到,他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案,称为荧光原位测序(fluorescentinsitusequencing)。这一技术将荧光原位杂交和RNA-Seq结合起来,能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。
Church的团队通过荧光原位测序证实,转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。(Science禁止透露进一步的细节)
这样的数据在十年前简直难以想象。同样,我们也很难想象NGS在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。
来源:生物探索
你可以用你的目的引物,用反转录第一链进行扩增,看看能不能得到目的片段.

