【求助】测序成功的重组质粒酶切后得不到目的条带
2015-12-28
问题描述：
片段长度143bp，酶切位点kpn1和Hind3，连入pGL3b载体，测序引物公司用的pGL3-，第一次反向测序不成功，原因是质粒出现重叠峰，正向加测后成功，对比发现下游引物的酶切位点（Hind3）少了一个碱基（aagtcc变成aagct），重组质粒酶切切不出插入片段；之后将测序成功的质粒重新转化DH5α，再提质粒酶切还是切不出来。质粒小提试剂盒是Qiagen的，提取菌液1.5mL，浓度608.2ng/uL，酶切质粒2ug。
【之前构建的4个重组质粒里也有两个出现这样的问题（aagtcc变成agtcc），但是酶切能切出插入的片段】
目前问测序公司得到的答复是样品可能不是单克隆，测序结果是不准确的，建议重新挑取单克隆测序。
不知道还有没有别的方法？
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ULYSSEESWB
用户
pGL3已经构建好了，并测序正确，为什么要酶切。另外，酶切位点是引物带的，只要引物合成没问题，一般不会有突变。还有就是，有的测序仪器会把两个相邻相同碱基读成一个信号，所以还要看看测序峰图，是否真的为一个碱基
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tdui
用户ULYSSEESWBpGL3已经构建好了，并测序正确，为什么要酶切。另外，酶切位点是引物带的，只要引物合成没问题，一般不会有突变。还有就是，有的测序仪器会把两个相邻相同碱基读成一个信号，所以还要看看测序峰图，是否真的为一个碱基因为要中提上细胞，所以做个酶切鉴定一下。测序峰图183、184位均有绿色的峰，但只测出一个碱基A，143位还有个黑色的峰G请问这样的结果是测序的问题吗？酶切位点有没有问题呢？是否可以酶切？
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ULYSSEESWB
用户正常来说，一般是先酶切后测序，测序结果正确就算构建成功了。其实pgl3连响应元件，就算酶切位点突变也没什么影响。至于峰图，还是有不少套峰，也许是质粒有污染，也可能是测序问题，建议换家测序公司
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tdui
用户ULYSSEESWB正常来说，一般是先酶切后测序，测序结果正确就算构建成功了。其实pgl3连响应元件，就算酶切位点突变也没什么影响。至于峰图，还是有不少套峰，也许是质粒有污染，也可能是测序问题，建议换家测序公司嗯嗯，谢谢您的回复，今晚重复实验成功了
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ULYSSEESWB
用户tdui嗯嗯，谢谢您的回复，今晚重复实验成功了
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Sapling_zhe
用户楼主请问一下是怎么解决这个问题的，我连了目的基因，测序也是正确的，可是就是酶切一直没有目的条带，心累啊啊啊啊啊
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tdui
用户Sapling_zhe楼主请问一下是怎么解决这个问题的，我连了目的基因，测序也是正确的，可是就是酶切一直没有目的条带，心累啊啊啊啊啊先看看测序结果里面酶切位点的地方有没有碱基突变或者缺失，再有根据目的基因与载体的碱基比例调整下酶切鉴定的体系，不行的话再把阳性克隆挑出来都酶切鉴定一遍，成功的再送测序吧，祝顺利~
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