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| Microarray Panel | Ovarian carcinoma tissue microarray, 150 cores including 75 cases of uninvolved and neoplastic tissues of the ovary in duplicates | |
| Cores | 150 |
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| Cases | 75 | |
| Row number | 10 | |
| Column number | 15 | |
| Core Diameter (mm) | 1.1 | |
| Thickness (µm) | 4 | |
| QA/QC | H&E, IHC anti-Cytokeratin | |
| Tissue Array Type | FFPE | |
| Species | Human | |
| Applications | Routine histology procedures including Immunohistochemistry (IHC) and In Situ Hybridization (ISH), protocols which can be found at our support page. | |
| Notes | 1. TMA slides were sectioned and stored at 4°C and may not be fresh cut, but still suitable for IHC. Please request fresh cut if experiment involves phospho-specific antibodies, RNA studies, FISH or ISH, etc. A minimum of 3 slides per TMA must be purchased to cover the cost of trimming for fresh sectioning.2. Most TMA slides were not coated with an extra layer of paraffin (tissue cores can be easily seen on the glass). To prevent tissue detachment during antigen retrieval, unbaked slides must be baked for at least 30 to 120 minutes at 60°C. before putting into xylene for de-paraffinization. Baked slides were sent out baked for 2 hours.In the following specsheet,“*” means invalid core; “-” means no applicable or negative in IHC markers. | |
Mouseover and click individual cores to view high resolution images.
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| A |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| C |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| D |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| E |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| F |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| G |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| H |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| I |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  | ||
| J |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
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运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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通善 cDNA文库构建/EST测序分析 实验技术服务基因组DNA提取服务项目材料要求服务价格获得DNA量周期细菌基因组DNA提取对数生长期的新鲜菌液1-2ml50元/样品1-2ug1-2周细胞基因组DNA提取1×106新鲜或冻存的细胞50元/样品≈10ug1-2周血液基因组DNA提取1ml新鲜或液氮冻存的样本50元/样品≈10ug1-2周组织基因组DNA提取100mg新鲜或-20度冻存的样本50元/样品≈10ug1-2周服务项目材料要求 查看更多
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上海研卉生物科技有限公司在发布的抗体纯化制备试剂盒供应信息，浏览与抗体纯化制备试剂盒相关的产品或在搜索更多与抗体纯化制备试剂盒相关的内容。 查看更多
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2019-03-25
Illumina台式二代测序仪是由北京安麦格贸易有限公司代理或销售的Illumina品牌的仪器，产品来源于美国。北京安麦格贸易有限公司是中国最权威的Illumina台式二代测序仪销售服务商之一，在北京等地方销售Illumina台式二代测序仪已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业Illumina台式二代测序仪仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的Illumina台式二代测序仪产品 查看更多
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2021-07-30
创伤弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是由广州迪澳生物科技有限公司代理或销售的广州迪澳生物科技有限公司品牌的试剂，产品来源于广州。广州迪澳生物科技有限公司是中国最权威的创伤弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）试剂销售服务商之一，在广州等地方销售创伤弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业创伤弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的创伤弧菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）产品 查看更多
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2018-05-04
全基因组测序是指对全部基因组的完整测序，是决定一套完整染色体基因组上核苷酸碱基准确顺序组成的过程。基因组测序是一项庞大的工程，其中三个必需关键技术是DNA大片段的克隆、测序的自动化和用生物信息学处理数据，当一个基因组完成测序之后，应该对其进行注释。全基因组测序主要应用于癌症。 1.基因检测：指通过基因芯片对被测者细胞中的DNA分子进行检测，分析出被检测者所含的各种致病基因和疾病基因情况的一种技术。 详细说明： 基因检测是通过血液、其 查看更多
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2018-03-24
Enzymatics国内代理 面议 上海市 苏州蚂蚁淘实验试剂有限公司 2016-11-24 在线询价>猜你喜欢人白细胞分化抗原30(CD30)ELISA试剂盒 本生(天津)健康科技有限公司 人... 查看更多
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2018-10-04
上海美轩生物科技有限公司在发布的基因组重测序/二代测序/高通量测序供应信息，浏览与基因组重测序/二代测序/高通量测序相关的产品或在搜索更多与基因组重测序/二代测序/高通量测序相关的内容。 查看更多
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2021-08-02
对虾白斑综合症病毒（WSSV)核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是由广州迪澳生物科技有限公司代理或销售的品牌的试剂，产品来源于广州。广州迪澳生物科技有限公司是中国最权威的对虾白斑综合症病毒（WSSV)核酸检测试剂盒（恒温荧光法）试剂销售服务商之一，在广州等地方销售对虾白斑综合症病毒（WSSV)核酸检测试剂盒（恒温荧光法）试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业对虾白斑综合症病毒（WSSV)核酸检测试剂盒（恒温荧光法）仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的对虾白斑综合症病毒（WSSV)核酸检测试剂盒（恒温荧光法 查看更多
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2021-07-25
IlluminaNextSeq550高通量二代测序系统是由北京安麦格贸易有限公司代理或销售的Illumina品牌的仪器，产品来源于美国。北京安麦格贸易有限公司是中国最权威的IlluminaNextSeq550高通量二代测序系统销售服务商之一，在北京等地方销售IlluminaNextSeq550高通量二代测序系统已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业IlluminaNextSeq550高通量二代测序系统仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的IlluminaNextSeq550高通量 查看更多
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2018-12-26
最糟糕的心态 - 实验失败了，抱怨试剂不好。实验人员本来是应该拥有修正主义、机会主义、怀疑论等诸多“不完美的”意识，所以一定要用“完美的”自我批评意识来平衡。我为什么没有一双慧眼选择可靠的供应商？我为什么不做预实验检测所购试剂？最糟糕的知识 - RNase A 的作用。RNase A 是内切酶，内 查看更多
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2021-07-19
鹅源性成分(Goose)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 查看更多
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DNA测序原理和方法 实验方法123
萌神90DZ912017-10-05
DNA测序的测序原理：
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。
另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。
其原理是化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。
另一个原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
【求助】买的空载体质粒,酶切鉴定正常,但是测序双峰,该怎么解决...123
zhangxcw2011-07-28
从addgene买的质粒，送来的是菌液，划板培养，挑单克隆，小提后酶切鉴定正常，送去测序结果是双峰。根据公司的建议，重新挑克隆，结果还是双峰！后来换了一家公司，也是双峰。测序引物特异。
请教高人，这样的问题怎么解决？
多谢
请教高人，这样的问题怎么解决？
多谢
【求助】请教DOPPCR和ALUPCR在扩增BAC/PAC DNA制备探针...123
hansontcm2021-08-03
请教DOP-PCR和ALU-PCR在扩增BAC/PACDNA制备探针文库时的优劣，或者说都可以。
HiSeq 2000,HiSeq 2500,Illumina二代测序仪性能参数,报价/价格,...123
小煜PLVE2021-07-27
不是的，这是第一代国产的高通量测序仪，是有紫鑫药业和中科院基因组研究所合作研发的，用于核酸测序。
基因测序是什么意思,基因测序怎么读_在线字典123
守望相依ぃ7312017-10-02
很不错的，佳学基因利用基因检测技术和基因解码技术，可以进行天赋潜能发现和评估。利用肿瘤基因检测进行肿瘤风险评估。这个根医院的体检不一样。佳学基因肿瘤风险基因检测可以在没有发病的时候，发现疾病风险，通过积极预防，将肿瘤发病风险消除在萌芽之中。通过佳学基因检测，还可以发现肿瘤的致病机理，采用不同于化疗、放射性治疗不一样的治疗方法。因此，佳学基因基因检测，代表的是一种更先进的健康管理技术。这种技术经过佳学基因进一步发展，用在了肿瘤分子分型基因检测，常见疾病风险评估、分子病理分型、药物的选择和剂量优化中，从不同层面提高我们的生活品质。由于基因检测的预见性，它可以知道在两个人婚后，所生的孩子的天赋潜能、性格特征等。一句话，基因检测、基因解码技术是人体生命活动信息利用技术，它不同于医院体检。您选用正确的基因检测技术，就表明您在生活能力、健康管理、家庭幸福方面已经比别人先行一步了。
有谁能详细说一下全基因组Bisulfite Sequencing的流程 123
天宇29372021-07-20
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.
第一部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min.
7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）
7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.
9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度,过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；
3）42度, 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；
7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.
3：取白斑,划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度,孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.
第一部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min.
7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）
7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.
9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度,过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；
3）42度, 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；
7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.
3：取白斑,划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度,孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.
请问前辈们哪种RNA抽提试剂盒比较好用? 分子生物 核酸提取...123
youzi8212021-07-30
核酸(DNA/RNA)提取试剂盒(磁珠法)和核酸(DNA/RNA)提取试剂盒(磁珠法...123
没事看看00322021-08-02
目前abi的是比较好的
比单细胞DNA测序更胜一筹,准确描述单个癌细胞特征123
寻找涵の2012017-10-12
1、目标序列靶向测序是一种对感兴趣的基因组区域进行富集测序的研究策略。目标区域测序的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，能够更为经济有效地研究特定区域的遗传变异。
2 单细胞测序是指单个细胞水平上对基因组进行测序。
3、靶向测序步骤为 样品准备、探针/引物设计、目标序列捕获、文库制备、上机测序、数据分析。
4、单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增（全基因组扩增和全转录组扩增）---测序以及后续的分析和应用。
相同:使用二代测序
不同：样本处理，文库构建，检测的区域，数据分析流程
2 单细胞测序是指单个细胞水平上对基因组进行测序。
3、靶向测序步骤为 样品准备、探针/引物设计、目标序列捕获、文库制备、上机测序、数据分析。
4、单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增（全基因组扩增和全转录组扩增）---测序以及后续的分析和应用。
相同:使用二代测序
不同：样本处理，文库构建，检测的区域，数据分析流程
2020年12月_wangprince2017_wangchuang2017123
稻子04E2017-10-03
最主要的是技术的更新，另外还有一部分是市场的占有策略。
1，测序技术的改进：全基因组主要应用的是illumina的Hiseq X10的测序平台，该平台在图片信息处理和flowcell上都有很大的改进（原来是平板上长簇，现在上面有小孔），另外在扩增的技术上也有一点改进（RPA扩增技术）。以上几点使得数据的通量大大调高。所以相应的测序价格也会降低。
2，市场占有策略：这一点我个人理解比技术更新更重要，illumina的战略思路，占有测序市场。其实illumina的Hiseq X10的测序平台试剂要比其他平台的试剂便宜很多。不过这个平台签有协议，只能做人的全基因组重测序项目。
1，测序技术的改进：全基因组主要应用的是illumina的Hiseq X10的测序平台，该平台在图片信息处理和flowcell上都有很大的改进（原来是平板上长簇，现在上面有小孔），另外在扩增的技术上也有一点改进（RPA扩增技术）。以上几点使得数据的通量大大调高。所以相应的测序价格也会降低。
2，市场占有策略：这一点我个人理解比技术更新更重要，illumina的战略思路，占有测序市场。其实illumina的Hiseq X10的测序平台试剂要比其他平台的试剂便宜很多。不过这个平台签有协议，只能做人的全基因组重测序项目。
RNA制备怎样才能万无一失仪器谱123
xq07121050252021-07-29
众所周知，RNA是一种相当不稳定的分子，它在这一方面可比DNA差远了。我们大家在实验室里基本上都耳闻目睹过，处理这种核酸时发生的悲惨故事。幸运的是，随着RNA研究逐渐成为主流，可供选择的商业化工具也越来越丰富越来越成熟。
RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意，又有哪些工具可以助我们一臂之力呢，且听下文分解。
RNA制备的四大祸害碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此，RNA操作一般在0°C-4°C的中性或微酸性缓冲液中进行，人们也常常在其中添加螯合剂，比如0.1mMEDTA。有些应用不允许EDTA的存在，这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。
在制备RNA时，RNase一直是个令人头疼的大问题，因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase，它们存在于细胞的小隔间里，当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外，实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是，我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂，也会沾到一些RNase，”Promega公司的产品经理EricVincent提醒道。
在收获组织或细胞时，“提取RNA要越快越好，或者就想办法令RNase失活，”NEB公司的RNA研究带头人BretRobb指出。
如果不能立刻提取RNA，就应当通过速冻来稳定样本，或者将样本储存在特殊的RNA保存液中，比如AllProtectTissueReagent、RNAlater。此外，PreAnalytiX公司的PAXgeneBloodRNATube也很适合保存这样的样本，“不仅能确保RNA的安全，而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本，”Qiagen公司的MartinSchlumpberger介绍道。PreAnalytiX是BD和QIAGEN的一个合资公司。
绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液（例如Qiagen公司的RNAEasy），“可以失活任何样本所带的RNAse，”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY，那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA。
据介绍，RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感，这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。
可不可以做到万无一失如何才能保证RNA实验的成功，这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套，并且在专门的空间里进行，尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。
我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase，而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿，抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道，目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品（试剂盒、试剂和耗材），进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。
“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊，恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌，以免把RNase带到样本中去，”他解释道。而现在，你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂，从水、1MTris到5MNaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”
许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证，MoBioLaboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线，”培训操作者如何识别和消除污染源，MoBio公司的CarlTsang介绍道。
我国大多数实验室还是使用玻璃器皿，这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时，才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后，研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测，比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。
添加剂的使用DEPC（Diethylpyrocarbonate）一直被用于处理水和溶液，失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除，因为DEPC在高温下很不稳定，会释放出CO2然后消失，”Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道，Schlumpberger强调，如果没有正确处理，残余的DEPC也会使RNA失活。
对于那些不能高压灭菌的器物，我们可以用RNaseAway试剂处理，然而将其浸泡在无RNAse的水里。
Vincent指出，RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例，RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse，包括RNAseA、B、C和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了，多加一层保险是很有必要的，”他说。
只要我们了解威胁RNA的主要因素（高pH、高温、金属离子和内切酶），就能够想办法一一化解。这时你会发现，RNA制备其实并没有那么难。
http://seq.cn/article-10584-1.html
RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意，又有哪些工具可以助我们一臂之力呢，且听下文分解。
RNA制备的四大祸害碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此，RNA操作一般在0°C-4°C的中性或微酸性缓冲液中进行，人们也常常在其中添加螯合剂，比如0.1mMEDTA。有些应用不允许EDTA的存在，这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。
在制备RNA时，RNase一直是个令人头疼的大问题，因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase，它们存在于细胞的小隔间里，当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外，实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是，我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂，也会沾到一些RNase，”Promega公司的产品经理EricVincent提醒道。
在收获组织或细胞时，“提取RNA要越快越好，或者就想办法令RNase失活，”NEB公司的RNA研究带头人BretRobb指出。
如果不能立刻提取RNA，就应当通过速冻来稳定样本，或者将样本储存在特殊的RNA保存液中，比如AllProtectTissueReagent、RNAlater。此外，PreAnalytiX公司的PAXgeneBloodRNATube也很适合保存这样的样本，“不仅能确保RNA的安全，而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本，”Qiagen公司的MartinSchlumpberger介绍道。PreAnalytiX是BD和QIAGEN的一个合资公司。
绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液（例如Qiagen公司的RNAEasy），“可以失活任何样本所带的RNAse，”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY，那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA。
据介绍，RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感，这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。
可不可以做到万无一失如何才能保证RNA实验的成功，这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套，并且在专门的空间里进行，尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。
我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase，而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿，抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道，目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品（试剂盒、试剂和耗材），进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。
“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊，恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌，以免把RNase带到样本中去，”他解释道。而现在，你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂，从水、1MTris到5MNaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”
许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证，MoBioLaboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线，”培训操作者如何识别和消除污染源，MoBio公司的CarlTsang介绍道。
我国大多数实验室还是使用玻璃器皿，这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时，才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后，研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测，比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。
添加剂的使用DEPC（Diethylpyrocarbonate）一直被用于处理水和溶液，失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除，因为DEPC在高温下很不稳定，会释放出CO2然后消失，”Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道，Schlumpberger强调，如果没有正确处理，残余的DEPC也会使RNA失活。
对于那些不能高压灭菌的器物，我们可以用RNaseAway试剂处理，然而将其浸泡在无RNAse的水里。
Vincent指出，RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例，RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse，包括RNAseA、B、C和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了，多加一层保险是很有必要的，”他说。
只要我们了解威胁RNA的主要因素（高pH、高温、金属离子和内切酶），就能够想办法一一化解。这时你会发现，RNA制备其实并没有那么难。
http://seq.cn/article-10584-1.html
【求助】天根DNA提取试剂盒 核酸基因技术论坛123
nancy23102021-07-23
天根的DNA提取试剂盒中，组织样品要求先将组织制备成单细胞悬液，再进行下一步操作。http://www.tiangen.com/?productShow/t1/1/id/26.html请问大家用过这个试剂盒的是怎么操作的？
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