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SNP是遗传学研究是不可缺少的一部分，目前成熟的SNP分型方法有很多，各有各的特点和适用性，其中直接测序法是堪称为“金标准”的一种手段。但其由于受到分型通量及分型成本的限制，无法在大规模的分型项目中得到推广，因此随之产生了基于二代测序发并结合多重PCR技术的高通量SNP分型法。
随着二代测序技术的普及，相比Sanger测序，二代测序降低了测序读长，但是大大增加的测序通量同时大幅降低测序成本。利用二代测序进行SNP分型，不仅测序读长满足分型需求，可以同时对数十数百个位点，上千样本进行分型。二代测序结果判断准确，相比RFLP，Taqman，LDR等方法都通过间接结果来进行分型结果的判定，但是直接测序或二代测序法分型能都直接看到具体序列情况，SNP位点判断更加直观。
分型原理图
二代测序法主要通过PCR的方法，对目标SNP位点进行特异性捕获。为了提高分型的通量，目前主要采用多重PCR的方法同时对多个位点进行捕获（可同时对1-100位点进行分型）。
图一多重PCR的多SNP位点捕获
样本标签添加由于二代测序通量是足够满足数百数千样本的同时测序，因此需要对不同的样本添加唯一的样本标签（Barcode），从而在后续数据分析过程中，能够进行样本拆分。
因此在多重PCR完成第一轮多SNP位点捕获后，需要进行第二轮PCR，在第一轮PCR产物的基础上，添加样本样本标签及测序接头等序列。通过PCR条件优化，目前亦可实现一次反应，两轮PCR接力完成的效果。
图二添加样本标签序列
结果判读上机测序后，每个样本同一个SNP位置可以读到数十或数百条reads（具体取决于测序通量），并且能够清晰看到每条序列的具体信息，通过对SNP位点的聚类分析，实现位点基因型的判断。
图三SNP位点序列情况
下图为大规模样本中二等位基因reads比分布结果，每一个点代表一个样本一个SNP位点的聚类结果，两端表示纯和，中间表示杂合（理想情况，1/0表示纯和，0.5表示杂合）。
图四位点聚类分析结果图
二代测序法技术特点
上海翼和生物自主研发的超高重PCR技术，扩增引物经修饰及优化，克服了传统多重PCR扩增效率不均一问题，95%以上扩增子的测序深度在平均测序深度的0.2X范围，保证测序通量的有效利用。
基于超高重PCR技术平台的高通量二代SNP分型服务，适用于多种遗传学研究领域，如疾病与基因的关联分析，临床分子诊断研究，QTL定位及分子育种等大规模多位点大样本的SNP分析。
上海翼和应用生物技术有限公司
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发布于 ： 2021-08-28
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