【求助】过表达不升反降，干扰不降反升
2021-07-22
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caatt
用户
我也是在做这个诶。用G418筛选出来的几个混合细胞株，仅仅是有些会有过表达。你可以试试挑选单克隆。
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ccyyatt521
用户谢谢你我之前过表达就是挑单克隆鉴定的，挑了可能有三四十个都没有，师兄说不会有做不出来的过表达，我就是想不明白可能的原因
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caatt
用户ccyyatt521谢谢你我之前过表达就是挑单克隆鉴定的，挑了可能有三四十个都没有，师兄说不会有做不出来的过表达，我就是想不明白可能的原因太可怕了挑了三四十也这样。。我是做到扩增单克隆这一步。还没到最后跑western检测呢。前几天将几个pool跑了胶，7个pool只有3个是抬高的。今天不放心又做了3个96孔板。你选的这个细胞应该本来表达也不低吧？所以过表达也不明显。如果瞬时转染甚至加G418筛选之后没有抬高，说明阳性细胞很少很少，这里面有个概率问题，比如说1百个里面只有1个，再加上运气不佳，挑了三四十个克隆没有一个阳性是有可能的。个人感觉。。。质粒序列包括抗性序列和你的目的蛋白序列。转进基因组，有几种可能，一个是两个片段都转进去了两个都开始表达，这是我们想要的阳性细胞；一个是只有抗性序列转进去了抗性序列在表达目的蛋白没有表达，或者说即使目的蛋白转进去了但是它就是不表达（因为对细胞生存不是需要的），这是假阳性，所以才需要挑选。蛮讲运气的感觉。就是说都是假阳性啊。。。
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caatt
用户之前我师姐说挑了三四十个挑出来7个。。我感觉我有一个就已经很开心了。。。
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caatt
用户还有要考虑western内参齐不齐。怀疑你上样量不一致。
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wns维诺赛
用户展开引用ccyyatt521大家好，最近做实验遇到了很棘手的问题：克隆一个基因，构建好过表达质粒载体，稳定转染细胞，g418筛选稳定克隆，让其在细胞系中过表达，但westernblot显示大部分克隆基因的表达量下降，没有挑出稳定过表达的克隆；接着做shRNA干扰，交给公司合成了四种shrna质粒，也是打算进行稳定转染，g418筛选，但先做了个瞬时转染预实验，转染换液后48小时收蛋白，westernblot鉴定，发现实验组都比对照高。请问，有没有大神遇到过这种情况，如果有，可能的原因是什么，有没有解决的方法，有没有相关的文献支持？谢谢，不胜感激！......武汉维诺赛生物可以提供shRNA表达载体构建服务，价格合理，可保证实验周期与质量，有意可私聊。公司服务网址：http://www.viraltherapy.cn/detail.aspx?node=FZ1&id=907
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