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相关疾病：乳腺癌肿瘤盲《美国医学会杂志肿瘤学》（JAMAOncology）发表的一项最新研究结果显示，如果转移乳腺癌阳...

:~)
各位老师:
我做RNA干扰实验,采用方案是shＲＮＡ表达质粒，我的问题就是质粒转染细胞后，是否需要将转染的细胞进行单克隆啊，如果说要单克隆化的话只是筛选就得化很长时间啊，望高手帮助啊？急啊

大家好，最近做实验遇到了很棘手的问题：
克隆一个基因，构建好过表达质粒载体，稳定转染细胞，g418筛选稳定克隆，让其在细胞系中过表达，但westernblot显示大部分克隆基因的表达量下降，没有挑出稳定过表达的克隆；
接着做shRNA干扰，交给公司合成了四种shrna质粒，也是打算进行稳定转染，g418筛选，但先做了个瞬时转染预实验，转染换液后48小时收蛋白，westernblot鉴定，发现实验组都比对照高。
请问，有没有大神遇到过这种情况，如果有，可能的原因是什么，有没有解决的方法，有没有相关的文献支持？
谢谢，不胜感激！

克隆技术类危害

请问基突变事坏事我已经搜索我要答案请要做所用复制工作请知道朋友告诉我谢谢

本人最近在对家族性遗传性高钙血症（FHH）的家族进行了多个可疑致病基因进行测序，测序公司已经给出了DNA的测序峰图及突变位点，但不知道这个突变是否是致病突变？还有如何才能知道该突变是否影响了氨基酸序列呢？本人在这方面零基础，麻烦稍微讲详细点，在这里先谢谢各位哥哥姐姐了，不胜感激！！！

现在看来是一个很古老的话题似的，其实前年8月我写这篇文章的时候相关的文献都找不到几篇的。忽如一夜春风来，铺天盖地的RNAi文章出现。现在看来有点简单，但仍不失为我当年呕血之作。只是肿瘤发表周期太慢而已。
(题外话)
谨以此文献给可爱的小海豚，祝暑假在家，在海边玩儿得开心!
　　　　　　RNA干扰和肿瘤基因治疗
摘要：RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指双链RNA诱导细胞内特定基因转录后沉默现象，它在肿瘤基因治疗中具有十分重要的作用。本文介绍了RNAi现象的发现、形成机理及其在肿瘤基因治疗中的应用现状及前景。
关键词：RNA干扰　肿瘤　基因治疗
Abstract：RNAinterferenceisaphenomenonthatds-RNAs(double-strandedRNA)inducespecificgeneposttranscriptionalsilencingincells.ItsuggeststhatRNAinterferencemayplayanimportantroleintumorgenetherapy.ThisarticleistointroducehowRNAinterferencewasfound,　formedaswellasitspotentialapplicationinthetumorgenetherapyfield.
Keywords：RNAinterference　　tumorgenetherapy
1RNAi现象的发现
1990年，来自美国的Napoli[1]和荷兰的Krol[2]分别报将外源性紫色色素合成基因查尔酮合酶（ChalconeSynthase，CHS）基因转入矮牵牛，试图产生出更深的紫色牵牛花，结果却发现花色素甙的合成发生了阻塞，大部分转基因植物开出了颜色斑驳或白色的花。检查白色花发现CHS基因mRNA的同步表达没有改变，而mRNA的转录比野生型减少50倍。导入基因和内源性基因均发生失活，这种现象被称为共抑制（co-suppression)。随后多个植物学家亦在不同转基因植物中发现类似现象。与此同时，意大利Macino[3]领导的实验室将外源性类胡萝卜素基因albino-3导入红色面包霉菌（Neurosporacrassa），发现约30%转化细胞的内源性的albino-3也受到了抑制，这种现象被他们称为静息作用（quelling）。
不仅植物和真菌如此，科学家们还在线虫发现类似的现象。1995年美国的Guo等[4]用反义RNA技术阻断线虫（CaenorhaBDitiselegans）par-1基因的表达以破坏线虫胚胎发育的对称性。结果发现不仅反义RNA能阻断par-1的表达，正义链RNA亦能抑制par-1的表达。他们将其称为RNA干扰。这种现象直到3年以后才得到解释。1998年Fire和Mello[5]公布了他们的实验结果，他们将少量双链RNA(dsRNA)注入线虫，发现内源性基因的mRNA发生特异性裂解。这种只需几分子外源dsRNA就能完全阻断特异内源基因表达的RNA干扰技术又被他们称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。紧接着这种现象在果蝇、拟南芥菜、水螅、涡虫、斑马鱼等较多真核生物中得到证实。
RNA干扰技术研究得最为广泛最为深入的是哺乳类动物。德国科学家Elbashir等[6]用核糖核酸酶III从长链dsRNA切取到21或22个核苷酸(nt)的小干扰RNA双倍体(smallinterferingRNAduplexes,siRNA)，将其转入不同的哺乳动物细胞系，能观察到内源性和外源性基因的特异性表达抑制。随后他们又用21-ntsiRNA成功特异性抑制哺乳动物细胞系的16个基因表达，并将这种技术和沉默基因敲除(knockoutofmurinegenes)技术进行比较，证实siRNA干扰技术能更准确、快捷地确定特定基因在生物发育和生长中的功能[7]。他们认为，21-ntsiRNA二倍体技术可能会在哺乳动物细胞基因功能的研究中发挥更大的作用，并有可能被用来进行特异性的基因治疗。荷兰科学家Brummelkamp等[8]则采用一种pSUPER质粒作为载体，这种载体带有一个H1-RNA启动子，克隆入载体的序列转录出来的RNA形成发卡状结构（smallhairpinRNAs，shRNAs)，在体内加工后形成类似siRNA分子，能引发基因沉默。这种载体对能够在瞬时转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNA，引发更为持久的基因沉默。

国家自然科学基金资助项目，批准号30170961
*Tel:(020)61643265,Fax:(020)61643265,E-mail:zjxrx@163.net
2RNAi的形成机理
　　RNAi如何引发基因沉默？其形成机理目前尚不完全清楚。最初Hamilton等[9]发现在发生共抑制植物中发现一些约25个碱基的RNA，这些RNA与沉默基因的正义链和反义链互补，这为揭示RNAi机理提供了重要线索。接着Zamore等[10]发现外源性的dsRNA在果蝇细胞内被切割为约21-23碱基对的双链片段。随后一些与RNAi相关的酶被发现，其中最重要的是dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA-specificendonuclease,DICER)，推测该酶具有RNaseⅢ类核酶的性质。目前一般认为可能是dsRNA进入胞体内后可激活RNA核酸酶如DICER,在其作用下形成21-23碱基对的siRNA，siRNA解链或其它原因形成RNA诱导基因沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，这些RISC可专一性地与靶向的mRNA特异性结合，在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下可形成新的dsRNA，新的dsRNA又被DICER识别而被切断形成siRNA，如此逐级放大式的作用形成大量新的siRNA，使RNAi作用在短时间内有效地抑制mRNA的表达[11]。而不少科学家设计的克隆入特定序列的载体转入靶细胞后能持续表达shRNAs，经修饰后形成siRNA，或者直接将siRNA注入靶细胞，作用原理基本一致。
3　RNAi在肿瘤基因治疗中的应用
目前认为RNAi是一种古老的自我防御的进化机制。它的主要作用是防御病毒感染和维持基因组中转座子的稳定。随着对RNAi机理的进一步研究，发现它是一种非常有用的研究工具。现已逐步用于研究基因的功能和了解生物的发育，它比在基因编码区加入选择性标记的基因敲除技术更优越。由于RNAi的技术操作的可行性和致基因沉默特性，已经有学者考虑将其引入肿瘤的基因治疗。
肿瘤基因治疗按其原理可常规性地分为细胞因子基因治疗、抑癌基因治疗、反义核酸治疗、自杀基因治疗、抗肿瘤血管生成治疗，而RNAi技术的提出只有短短5年时间，实验性应用于治疗肿瘤只有不到2年时间，但已取得不少令人振奋的结果。RNAi理论上有望成为一种新的肿瘤基因治疗方案。
德国学者Wilda等[12]在应用RNAi治疗白血病方面做出了有益的试尝。他们针对M-BCR/ABL基因设计出21-ntdsRNA，并将其转入白血病细胞系K562，通过实时PCR定量和westernblot检测，发现细胞中不能检测到M-BCR/ABLmRNA和M-BCR/ABL癌蛋白，还能观察到强烈的细胞凋亡现象。实验结果提示利用dsRNA转导能抑制内源性M-BCR/ABL基因mRNA表达，降低细胞恶性型，甚至导致细胞凋亡。随后日本学者Cioca等[13]报道他们设计针对c-raf和bcl-2基因的dsRNA转入髓样白血病细胞系HL-60、U937、THP-1和K562，发现转染后细胞系c-raf和bcl-2基因表达raf-1和bcl-2蛋白明显降低；针对c-raf基因的RNAi作用阻止TPA诱导单细胞分化出现；联合针对c-raf和bcl-2的RNAi能诱导HL-60、U937和THP-1细胞系的凋亡，并增强了其对依托泊甙和柔红霉素的敏感性。作者认为联合针对c-raf和bcl-2的RNAi能克服白血病瘤细胞对化疗药物的抵抗作用，可能为肿瘤治疗提供一条新途径。
种种迹象表明，用RNAi技术特异性抑制瘤细胞癌基因的表达能在肿瘤基因治疗中扮演重要作用，但怎样将dsRNA导入靶细胞则成为一个难题。显然采用短链dsRNA比长链dsRNA具有很大技术上的可行性，用细胞注射方式转入外源基因在临床基因治疗中是不合适的。Brummelkamp等[14]在构建pSUPER质粒载体的基础上，构建了带有H1-RNA启动子的逆转录病毒载体，设计针对K-RAS(V12)基因的小基因片段，克隆入载体后转至多种人癌细胞系，能持续表达siRNA，观察发现K-RAS(V12)基因被特异性抑制表达，肿瘤细胞恶性型明显降低。作者认为利用病毒载体导入siRNA用于肿瘤特异性基因治疗可抑制癌细胞的致瘤表型。
随着RNAi技术在肿瘤基因治疗中的试尝不断增多，有必要将其与其它基因治疗方法进行比较。日本学者Aoki等[15]将RNAi技术和反义核酸技术应用于人癌细胞系进行了比较。他们选取人肝癌细胞系和胰癌细胞系作为靶细胞，分别选取外源性的虫荧光素酶基因和内源性的c-raf基因作为靶基因，采用阳离子脂质体和一种他们研制的瘤细胞靶向性肽链作为载体，分别采用RNAi技术和反义核酸技术对靶基因进行干扰。结果提示RNAi技术比反义核酸技术能更有效地抑制人癌细胞系中靶基因的表达，作者认为RNAi技术可能成为一种更新、更有效的基因治疗途径。
RNAi技术可以采用长链dsRNA，也可以采用短链siRNA，还可以用带启动子的载体转入可以表达核内不均一RNA（heteronuclearRNA,hnRNA）的基因片段。hnRNA技术是指siRNA并非由外源dsRNA直接导入，而是利用带启动子的载体将能表达siRNA的基因导入细胞，在细胞内自行合成siRNA，从而发挥干扰作用。目前认为最持久、稳定沉默靶基因的办法就是hnRNA技术。然而怎样根据靶基因序列寻找最佳干扰位点并设计能转录出hnRNA的基因片段是一个新挑战。有报道只有不到50%的短序列能针对特异基因形成RISC，而只有不到10%能产生特异效果，一位澳大利亚学者Benitec的专利技术能找到针对人类特定基因的最佳干扰位点并设计出带启动子终止子的一段呈反向互补回文结构的DNA序列，利用载体转入靶细胞后即可转录出发卡状mRNA，发挥其干扰作用，其网址为http://www.benitec.com.au/gene-silencing.htm。美国著名RNA产品公司Ambion提供网上在线设计工具，可以用来更快、更有效地寻找最佳干扰位点，网址为http://www.ambion.com/techlib/misc/。目前一般认为，选取的21nt-RNAs应取自靶基因，其5’端应以AA开头，应用Blast到EST基因库搜索，确认靶向性基因是唯一的，siRNA序列GC含量最好在40-55%。
总之，随着人们对RNAi技术认识的更加深刻，RNAi技术将更广泛地用于肿瘤的治疗。将RNAi技术和其它基因治疗方法结合而设计针对肿瘤的治疗方案，将产生不可估量的潜力，必将探索出一条攻克恶性肿瘤的新路。
　
参考文献
1NapoliC,LemieuxC,JorgensenR.IntroductionofaChimericChalconeSynthaseGeneintoPetuniaResultsinReversIBLeCo-SuppressionofHomologousGenesintrans.PlantCell.1990;2(4):279-289
2vanderKrolA,MurL,BeldM,etal.Flavonoidgenesinpetunia:additionofalimitednumberofgenecopiesmayleadtoasuppressionofgeneexpression.PlantCell.1990;2(4):291-299
3RomanoN,MacinoG.Quelling:transientinactivationofgeneexpressioninNeurosporacrassabytransformationwithhomologoussequences.MolMicrobiol.1992;6(22):3343-3353
4GuoS,KemphuesK.par-1,agenerequiredforestablishingpolarityinC.elegansembryos,encodesaputativeSer/Thrkinasethatisasymmetricallydistributed.Cell.1995;81(4):611-620
5FireA,XuS,MontgomeryM,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature.1998;391(6669):806-811
6ElbashirS,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001;411(6836):494-498
7HarborthJ,ElbashirS,BechertK,etal.IdentificationofessentialgenesinculturedmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs.JCellSci.2001;114(Pt24):4557-4565
8BrummelkampT,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science.2002;296(5567):550-553
9HamiltonA,BaulcombeD.AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants.Science.1999;286(5441):950-952
10ZamoreP,TuschlT,SharpP,etal.RNAi:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell.2000;101(1):25-33
11SijenT,FleenorJ,SimmerF,etal.OntheroleofRNAamplificationindsRNA-triggeredgenesilencing.Cell.2001;107(4):465-476
12WildaM,FuchsU,WossmannW,etal.KillingofleukemiccellswithaBCR/ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi).Oncogene.2002;21(37):5716-5724
13CiocaD,AokiY,KiyosawaK.RNAinterferenceisafunctionalpathwaywiththerapeuticpotentialinhumanmyeloidleukemiacelllines.CancerGeneTher.2003;10(2):125-133
14BrummelkampT,BernardsR,AgamiR.StablesuppressionoftumOrigenicitybyvirus-mediatedRNAinterference.CancerCell.2002;2(3):243-247
15AokiY,CiocaD,OidairaH,etal.RNAinterferencemaybemorepotentthanantisenseRNAinhumancancercelllines.ClinExpPharmacolPhysiol.2003;30(1):96-102

肿瘤见病发病其恶性肿瘤目前危害类健康严重类疾病.仅类患肿瘤、植物肿瘤
　　肿瘤机体各种致瘤素作用局部组织细胞基水平失其调控导致单克隆性异增形新物种新物形局部肿块名
　　肿瘤性增与非肿瘤性增具本质区别非肿瘤性增机体存所需所增组织能够化熟并且能够恢复原组织结构功能且种增具定限度旦原除再继续细胞转化肿瘤细胞具异形态、代谢、功能并同程度失化熟能力肿瘤旺盛并具相自主性即使致瘤素存仍能持续

　　肿瘤特异性
　　肿瘤组织论细胞形态组织结构都与其发源组织同程度差异种差异称异型性异型性肿瘤异化形态表现异型性说明化程度高异型性说明化程度低区别种异型性诊断肿瘤确定其良、恶性主要组织依据良性肿瘤细胞异型性明显般与其源组织相似恶性肿瘤具明显异型性
　　由未化细胞构恶性肿瘤称间变性肿瘤间变指恶性肿瘤细胞缺乏化异型性显著间变性肿瘤具明显形性瘤细胞彼形状变异往往能确定其组织源间变性肿瘤般具高度恶性
　　1、肿瘤细胞异型性
　　良性肿瘤瘤细胞异型性般与其源细胞相似恶性肿瘤瘤细胞具高度异型性表现特点：
　　（1）肿瘤细胞形性即肿瘤细胞形态致恶性肿瘤细胞般比细胞较见瘤巨细胞少数化差肿瘤其肿瘤细胞较圆形比较致
　　(2)瘤细胞核形性
　　瘤细胞核比细胞核增核、形状染色并现双核、巨核、核、奇异核、核着色深（由于核内DNA增）染色质呈粗颗粒状布均匀堆积于核膜使核膜显肥厚核裂像增特别现称性、极性及顿挫性等病理性核裂恶性肿瘤具诊断意义恶性肿瘤细胞核异改变与染色体呈倍体或非整数倍体关
　　（3）瘤细胞胞浆改变：由于胞浆内核蛋白体增呈嗜碱性瘤细胞产异泌物或代谢产物（激素、粘液、 蛋白、色素等）具同特点
　　（4）肿瘤细胞超微结构异型性：般说良性肿瘤超微结构与其起源组织基本相似恶性肿瘤细胞根据其化程度表现同异型性总说恶性肿瘤细胞通绝或相明显增核膜内陷或外凸使核形规则甚至形奇异型核胞浆内细胞器数目减少、发育良或形态异细胞连接减少利于肿瘤浸润
　　2．肿瘤组织结构异型性
　　肿瘤组织结构异型性指肿瘤组织空间排列式（包括极向、器官结构及其与间质关系等面）与其源组织差异良性肿瘤瘤细胞异型性明显排列与组织同诊断赖于组织结构异型性宫平滑肌瘤恶性肿瘤组织结构异型性明显瘤细胞排列更紊乱失排列结构、层或极向纤维肉瘤、腺癌
　　三、肿瘤扩散
　　具局部浸润远处转移恶性肿瘤重要特点并且恶性肿瘤致死亡主要原
　　1．肿瘤由转化细胞断增繁衍形
　　典型恶性肿瘤自史几阶段：
　　细胞恶性转化→转化细胞克隆性增→局部浸润→远处转移
　　程恶性转化细胞内特点（肿瘤数）宿主肿瘤细胞及其产物反应（肿瘤血管形）共同影响肿瘤演进
　　（l）肿瘤力肿瘤速度与三素关：
　　1）肿瘤细胞倍增间：肿瘤群体细胞周期G0、G1、S、G2M期数恶性肿瘤细胞倍增间并比细胞更快与细胞相似或比细胞更慢
　　2）数：指肿瘤细胞群体处于增殖阶段（S期+G2期）细胞比例恶性转化初期数较高随着肿瘤持续增数肿瘤细胞处于G0期即使迅速肿瘤数20%
　　3）瘤细胞与丢失：营养供应足、坏死脱落、机体抗肿瘤反应等素使肿瘤细胞丢失肿瘤细胞与丢失共同影响着肿瘤能否进行性及其速度
　　肿瘤速度决定于数肿瘤细胞与丢失比与倍增间关系目前化疗药物几乎均针处于增殖期细胞数高肿瘤（高度恶性淋巴瘤）于化疗特别敏见实体瘤（结肠癌）数低故化疗敏
　　（2）肿瘤血管形诱导血管能力恶性肿瘤、浸润与转移前提肿瘤细胞本身浸润肿瘤组织内及其周围炎细胞（主要巨噬细胞）能产类血管血管内皮细胞（VEGF）碱性纤维细胞（b－FGF）些血管促进血管内皮细胞裂毛细血管芽新毛细血管既肿瘤提供营养肿瘤转移提供利条件
　　（3）肿瘤演进异质化恶性肿瘤程变越越侵袭性现象称肿瘤演进包括加快、浸润周围组织远处转移等些物现象现与肿瘤异质化关肿瘤异质化指克隆源肿瘤细胞程形侵袭能力、速度、激素反应、抗癌药敏性等面所同亚克隆程由于些同肿瘤程保留些适应存、、浸润与转移亚克隆
　　2．肿瘤式与扩散
　　（1）肿瘤速度：各种肿瘤速度极差异主要取决于肿瘤细胞化熟程度良性肿瘤缓慢恶性肿瘤较快良性肿瘤恶变速度突加快
　　（2）肿瘤式：肿瘤呈膨胀性、外性浸润性
　　1）膨胀性：数良性肿瘤所表现式肿瘤缓慢侵袭周围组织往往呈结节状完整包膜与周围组织界明显周围器官、组织主要挤压或阻塞作用般均明显破坏器官结构功能其与周围组织界清楚手术容易摘除摘除易复发
　　2）外性：发体表、体腔表面或管道器官（消化道、泌尿殖道）表面肿瘤向表面形突起乳状、息肉状、菜花状肿物良性、恶性肿瘤都呈外性恶性肿瘤外性同其基底部呈浸润性且外性恶性肿瘤由于迅速、血供足容易发坏死脱落形底部高低平、边缘隆起恶性溃疡
　　3）浸润性：数恶性肿瘤式由于肿瘤迅速侵入周围组织间隙、淋巴管、血管树根入泥土浸润并破坏周围组织肿瘤往往没包膜或包膜完整与周围组织界明显临床触诊肿瘤固定手术切除种肿瘤防止复发切除范围应该比肉眼所见范围些部位能肿瘤细胞浸润
　　3．肿瘤扩散
　　恶性肿瘤主要特征具浸润性恶性肿瘤仅原发部位、蔓延（直接蔓延）且通各种途径扩散身体其部位（转移）
　　（1）直接蔓延：瘤细胞沿组织间隙、淋巴管、血管或神经束浸润破坏临近组织、器官并继续称直接蔓延例晚期宫颈癌蔓延至直肠膀胱晚期乳腺癌穿胸肌胸腔甚至达肺
　　（2）转移：瘤细胞原发部位侵入淋巴管、血管、体腔迁移处继续形与原发瘤同类型肿瘤程称转移良性肿瘤转移恶性肿瘤才转移见转移途径几种：
　　1）淋巴道转移：皮组织恶性肿瘤经淋巴道转移
　　2）血道转移：各种恶性肿瘤均发尤见于肉癌、肾癌、肝癌、甲状腺滤泡性癌及绒毛膜癌
　　3）种植性转移：见于腹腔器官癌瘤
　　4.恶性肿瘤浸润转移机制
　　（l）局部浸润浸润能力强瘤细胞亚克隆现肿瘤内血管形肿瘤局部浸润都起重要作用
　　局部浸润步骤：
　　1）由细胞粘附介导肿瘤细胞间粘附力减少
　　2）瘤细胞与基底膜紧密附着
　　3）细胞外基质降解癌细胞基底膜紧密接触4～8细胞外基质主要LN、FN、蛋白糖胶原纤维癌细胞泌蛋白溶解酶溶解使基底膜产局部缺损
　　4）癌细胞阿米巴运通溶解基底膜缺损处癌细胞穿基底膜重复述步骤溶解间质性结缔组织间质移达血管壁再同式穿血管基底膜进入血管
　　（2）血行播散单癌细胞进入血管般绝数机体免疫细胞所消灭血板凝集团瘤细胞团则易消灭通述途径穿血管内皮基底膜形新转移灶
　　转移发并随机具明显器官倾向性血行转移位置器官布某些肿瘤具特殊亲性肺癌易转移肾腺脑甲状腺癌、肾癌前列腺癌易转移骨乳腺癌转移肝、肺、骨产种现象原清楚能些器官血管内皮能与进入血循环癌细胞表面粘附特异性结合配体或由于些器官能够释放吸引癌细胞化物质

　　良性肿瘤与恶性肿瘤间并绝界限某些肿瘤组织形态介于两者间称交界性肿瘤卵巢交界性浆液性乳状囊腺瘤粘液性囊腺瘤即使恶性肿瘤其恶性程度亦各相同些良性肿瘤发恶性变化别恶性肿瘤停止甚至消退结肠息肉状腺瘤恶变腺癌别恶性肿瘤恶性黑色素瘤由于机体免疫力增强等原停止甚至完全消退见于少童神经母细胞瘤瘤细胞能发育熟神经细胞甚至转移灶瘤细胞能发育熟使肿瘤停止自愈种情况十罕见

　　肿瘤病发病
　　肿瘤本质基病各种环境遗传致癌素协同或序贯式引起DNA损害激原癌基（或）灭肿瘤抑制基加凋亡调节基（或）DNA修复基改变继引起表达水平异使靶细胞发转化转化细胞先呈克隆性增经漫阶段演进程其克隆相限制扩增通附加突变选择性形具同特点亚克隆（异质化）获浸润转移能力（恶性转化）形恶性肿瘤
　　1．肿瘤发物基础
　　（l）癌基
　　1)原癌基、癌基及其产物
　　癌基具潜转化细胞能力基由于细胞癌基细胞非激形式存称原癌基原癌基种素激
　　原癌基编码蛋白质都细胞十重要细胞受体血板（PGF）纤维母细胞（FGF）表皮细胞（EGF）重要信号转导蛋白质（酪氨酸激酶）核调节蛋白质（转录激蛋白）细胞周期调节蛋白（周期素、周期素依赖激酶）等
　　2）原癌基激
　　原癌基激两种式：①发结构改变（突变）产具异功能癌蛋白②b.基表达调节改变（度表达）产量结构促进蛋白
　　基水平改变继导致细胞刺激信号度或持续现使细胞发转化
　　引起原癌基突变DNA结构改变：点突变、染色体易位、基扩增突变原癌基编码蛋白质与原癌基产物结构同并失产物调节作用通式影响其靶细胞：①增加；②受体增加；③产突变信号转导蛋白；④产与DNA结合转录
　　（2）肿瘤抑制基
　　肿瘤抑制基产物能抑制细胞其功能丧失能促进细胞肿瘤性转化肿瘤抑制基失通等位基两突变或缺失式实现
　　见肿瘤抑制基Rb基P53基神经纤维瘤病—1基（NF－l）结肠腺瘤性息肉基（DCC）Wilms瘤基(WT－1）等Rb基纯合性缺失见于所视网膜母细胞瘤及部骨肉瘤、乳腺癌细胞肺癌等肿瘤Rb基定位于染色体13ql4Rb基两等位基必须都发突变或缺失才能产肿瘤Rb基隐性癌基
　　P53基异缺失包括纯合性缺失点突变超50％肿瘤P53基突变尤其结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌突变更见
　　（3）凋亡调节基DNA修复调节基
　　调节细胞进入程序性细胞死亡基及其产物肿瘤发起重要作用bcl－2抑制凋亡bax蛋白促进凋亡DNA错配修复基缺失使DNA损害能及修复积累起造原癌基肿瘤抑制基突变形肿瘤遗传性非息肉性结肠癌综合征
　　（4）端粒肿瘤
　　端粒随着细胞复制缩短没端粒酶修复体细胞能复制50肿瘤细胞存某种缩短机制几乎能够限制复制实验表明绝数恶性肿瘤细胞都含定程度端粒酶性
　　（5）步癌变基础
　　恶性肿瘤形期素形阶段程要使细胞完全恶性转化需要基转变包括几癌基突变两或更肿瘤抑制基失及凋亡调节DNA修复基改变
　　2．环境致癌素及致癌机制
　　（1）化致癌素
　　1）间接作用化致癌物：环芳烃芳香胺类与氨基偶氮染料亚硝胺类真菌毒素
　　2）直接作用化致癌物：些致癌物经体内化致癌烷化剂与酰化剂

　　（1）亚硝胺类类致癌性较强能引起物种癌症化致癌物质变质蔬菜及食品含量较高能引起消化系统、肾脏等种器官肿瘤
　　（2）环芳香烃类类致癌物苯并芘代表涂抹物皮肤引起皮肤癌皮注射则诱发肉瘤汽车废气、煤烟、香烟及熏制食品；
　　（3）烷化剂类芥气、环磷酰胺等引起白血病、肺癌、乳腺癌等；
　　（4）氯乙烯目前应用广种塑料聚氯乙烯由氯乙烯单体聚合诱发肺、皮肤及骨等处肿瘤通塑料工厂工流行病调查已证实氯乙烯能引起肝血管肉瘤潜伏期般15；
　　（5）某些金属铬、镍、砷等致癌
　　化致癌物引起体肿瘤作用机制复杂少数致癌物质进入体直接诱发肿瘤种物质称直接致癌物；数化致癌物进入体需要经体内代谢化或物转化具致癌性终致癌物引起肿瘤发种物质称间接致癌物放射线引起肿瘤：甲状腺肿瘤、肺癌、骨肿瘤、皮肤癌、发性骨髓瘤、淋巴瘤等

　　（2）物理致癌素
　　离辐射引起各种癌症期热辐射定致癌作用金属元素镍、铬、镉、铍等类致癌作用临床些肿瘤与创伤关骨肉瘤、睾丸肉瘤、脑瘤患者创伤史另类与肿瘤关异物寄虫
　　（3）病毒细菌致癌
　　1）RNA致瘤病毒：通转导插入突变遗传物质整宿主细胞DNA并使宿主细胞发转化存两种机制致癌：①急性转化病毒②慢性转化病毒
　　2）DNA致瘤病毒：见类乳状瘤病毒（HPV）与类皮性肿瘤尤其宫颈肛门殖器区域鳞状细胞癌发密切相关Epstein?barr病毒（EBV）与伯基特淋巴瘤鼻咽癌密切相关流行病调查乙型肝炎与肝细胞性肝癌密切关系幽门螺杆菌引起慢性胃炎与胃低度恶性B细胞性淋巴瘤发关
　　3．影响肿瘤发、发展内素及其作用机制
　　(1)遗传素
　　1）呈染色体显性遗传肿瘤视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、肾腺或神经节神经母细胞瘤些癌前疾病结肠发性腺瘤性息肉病、神经纤维瘤病等本身并恶性疾病恶变率高些肿瘤癌前病变都属于单基遗传染色体显性遗传规律现其发病特点早（童期）发病肿瘤呈发性累及双侧器官
　　2）呈染色体隐性遗传遗传综合征Bloom综合征易发白血病其恶性肿瘤；毛细血管扩张共济失调症患者易发急性白血病淋巴瘤；着色性干皮病患者经紫外线照射易患皮肤基底细胞癌磷状细胞癌或黑色素瘤些肿瘤易性高群伴某种遗传性缺陷三种遗传综合征均累及DNA修复基
　　3）遗传素与环境素肿瘤发起协同作用环境素更重要决定种肿瘤遗传素属于基目前发现少肿瘤家族史乳腺癌、胃肠癌、食管癌、肝癌、鼻咽癌等
　　（2）宿主肿瘤反应——肿瘤免疫
　　CD8+细胞毒性T细胞细胞免疫起重要作用
　　1）肿瘤抗原两类：①存于肿瘤细胞存与细胞肿瘤特异性抗原②存与肿瘤细胞与某些细胞肿瘤相关抗原
　　2） 抗肿瘤免疫效应机制肿瘤免疫细胞免疫主体液免疫辅参加细胞免疫效应细胞主要（CTL）、自杀伤细胞（NK）巨噬细胞
　　3）免疫监视免疫监视抗肿瘤机制力证据免疫缺陷病患者接受免疫抑制治疗病恶性肿瘤发病率明显增加
　　（3）其与肿瘤发病关素
　　1）内泌素：内泌紊乱与某些器官肿瘤发定关系乳腺癌发发展能与患者体内雌激素水平高或雌激素受体异关外激素与恶性肿瘤扩散转移定关系垂体前叶激素促进肿瘤转移肾腺皮质激素抑制某些造血系统恶性肿瘤
　　2）性别龄素：肿瘤发性别差异除殖器官肿瘤乳腺癌性较见胆囊、甲状腺膀胱等肿瘤性明显于男性肺癌、肝癌、胃癌结肠癌则男性于性性别种差异其原除部与性激素关外主要能与男染色体同某性别较接受致癌作用关龄肿瘤发定影响
　　3）种族理素

　　随着肿瘤本质认识断深入更由于肿瘤局部治疗停滞前恶性肿瘤逐渐看种全身性疾病由肿瘤治疗观念便发明显转向肿瘤综合治疗观应运
　　纵观恶性肿瘤治疗历史发展与衍变难看肿瘤外科、肿瘤放射治疗、肿瘤化治疗构现代肿瘤治疗三支柱.三种手段互特点互补充
　　治疗效应看外科手术放射治疗都局部治疗肿瘤外科家放射肿瘤家肿瘤概念结构认识极相似两者都认恶性肿瘤发局部侵犯周围组织、经淋巴管、血管或通自腔隙转移处治疗重点自放局部即控制局部局部扩散特别淋巴结转移药物治疗属于全身效应肿瘤化治疗专家除重视局部肿瘤外更着眼点放恶性肿瘤扩散转移于肿瘤治疗观点细胞指数杀灭观点故强调疗程、足剂量用药期能彻底杀灭绝部肿瘤细胞各种肿瘤同治疗疗效比较我能清楚看治疗优点与缺点作名肿瘤专科医,些处与足应该且必须数自我更应该注意单能达治愈肿瘤情况应联合使用同弥补各自足解剖角度看治疗原发部位肿瘤外科手术病灶放射全身化疗却能消灭镜转移灶另面治疗相互作用重要外科切除块病灶处残余肿瘤受刺激增殖能随化疗更敏；化疗能放疗增敏作用；激素治疗则由于其依赖细胞增殖能补充化疗足充考虑些面面我才能制订取佳治疗效恶性肿瘤治疗案
　　肿瘤治疗历经手术、放疗、化疗及物治疗近众者提肿瘤综合治疗概念所谓肿瘤综合治疗指：根据病机体状况、肿瘤病理类型、侵犯范围(病期)发展趋势计划合理应用现治疗手段期幅度提高治愈率说肿瘤治疗研究显示科合作与补充肿瘤治疗已进入综合治疗代肿瘤综合治疗根本思想系统论各组相加于各组代数作肿瘤综合治疗组手术化疗放疗及物治疗依照同病例特点进行机组合期达佳治疗效综合治疗癌瘤先切除原发病灶再辅化疗仅利于病情期同防止些化疗敏肿瘤手术切除机睾丸、肛门、喉咽等部位肿瘤尝试做术前化疗显示化疗效辅助化疗指采取效局部治疗针微转移癌灶防止复发转移进行化疗
　　肿瘤综合治疗看,综合手术、化疗、放疗及物治疗手段依据具体情况具体析原则针具体病例制订相应性化治疗案终达佳综合疗效
　　要攻克癌症我首先要探查 癌症起癌症起首先体内阴阳平衡组织细胞同致癌素期作用细胞突变引起主要表现组织细胞异度增其实癌组织体部本阴阳平衡失调五行克乘侮发变化前提体免疫监控系统才其失监控任其发展久久癌细胞益增殖肿瘤队伍益壮侵蚀周围组织消耗量能量营养影响体理代谢造机体逐渐衰竭终导致死亡

按照表型效应突变型区形态突变型、化突变型及致死突变型等区并涉及突变本质且严格形态突变致死突变必物化基础所严格讲切突变型都物化突变型
1.形态突变：结构镰刀型细胞贫血症；体水平红眼突变白眼
2.化突变：镰刀型细胞贫血症血红蛋白结构突变原理
3.致死突变：比隐性纯合致死

基因突变的主要特点：
普遍性：生物界中普遍存在
随机性：生物个体发育的任何时期和任何部位都有可能发生
低频性：突变频率很低
不定向性：可以产生一个以上的等位基因
多害少利性：一般是有害的少数是有利的

看了好多国内的文章，发现构建小干扰RNA载体时首先需要将特异性干扰RNA片断克隆入T载体，然后再亚克隆入表达载体。这样做的目的是什么呢？

应该：基突变发体细胞通性殖传给代.更确切些!
基突变代影响
①基突变发体细胞丝裂程通性殖传给代,通性繁殖传给代.
②基突变发精或卵细胞形减数裂程能通通性殖传给代.