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NEB/NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix/E2621S/250 reactions
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4000-520-616
Description:
NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMixwasdevelopedtoimprovetheefficiencyandaccuracyofDNAassembly.ThismethodallowsforseamlessassemblyofmultipleDNAfragments,regardlessoffragmentlengthorendcompatibility.Thismethodhasbeenusedtoassembleeithersingle-strandedoligonucleotidesordifferentsizesofDNAfragmentswithvariedoverlaps(15–80bp).IthasutilityforthesyntheticBIOLOGycommunity,aswellasthoseinterestedinone-stepcloningofmultiplefragmentsduetoitseaseofuse,flexibilityandsimplemaster-mixformat.Thereactionincludesdifferentenzymesthatworktogetherinthesamebuffer(seeFigure1):
- Theexonucleasecreatessingle-stranded3´overhangsthatfacilitatetheannealingoffragmentsthatsharecomplementarityatoneend(theoverlapregion)
- Thepolymerasefillsingapswithineachannealedfragment
- TheDNAligasesealsnicksintheassembledDNA
NEBuilderHiFiDNAAssemblykitsareavailableinvariousformats:withNEB5-alphacompetentcells(CloningKit,NEB#E5520),asabundlewithNEB10-betacompetentcells(BundleforLargeFragments,NEB#E2623)andwithoutcompetentcells(MasterMix,NEB#E2621).NEB5-alphacompetentcellscellsareexcellentforroutineassembliesof15kborless.NEBrecommendsNEB10-betaCompetentE.coli(HighEfficiency,NEB#C3019)orNEB10-betaElectrocompetentE.coli(NEB#C3020)forassemblieslargerthan15kb.Iftheassembledgenescontainrepetitivesequences,NEBStableCompetentE.coli(NEB#C3040)shouldbeused.
NEBuilderhasbeenusedinvariousapplications,including:
- Site-directedmutagenesis
- ConstructionofansgRNA-Cas9expressionvector|Animation
- Assemblyoflinearyeastexpressioncassettes
ForhelpdesigningyourprimersforusewithNEBuilder,pleaseviewourprimerdesignvideo.
NEBGibsonAssembly
ViewadditionalperformancedatacomparedtoNEBGibsonAssembly
ViewadditionalperformancedatacomparedtoIn-FusionHD
 | ComparisonofDNAAssemblyReactionTypes |
KitComponents
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| NEBuilder®High-FidelityMasterMix | -20 | |
| NEBuilder®PositiveControl | -20 | 2X |
Notes:
ToensurethesuccessfulassemblyandsubsequenttransformationofassembledDNAs,NEBrecommendsthefollowing:DNA:PCRproductpurificationisnotnecessaryifthetotalvolumeofallPCRproductsis20%orlessoftheassemblyreactionvolume.HighervolumesofPCRproductsmayreducetheefficiencyofhigh-fidelityDNAassemblyandtransformationduetotheelevatedcarryoveramountsofPCRreactionbufferandunusedprimerspresentinthePCRproduct.ColumnpurificationofPCRproductsmayincreasetheefficiencyofbothhigh-fidelityDNAassemblyandtransformationby2–10foldandishighlyrecommendedwhenperformingassembliesofthreeormorePCRfragmentsorassemblinglongerthan5kbfragments.PurifiedDNAforassemblycanbedissolvedinddH2O(Milli-Q®waterorequivalentispreferable),TEorotherdilutionbuffers.Insert:Whendirectlyassemblingfragmentsintoacloningvector,theconcentrationofassemblyfragmentsshouldbeatleast2timeshigherthantheconcentrationofvector.Forassemblyof4ormorefragmentsintoavector,werecommendusinganequimolarratiooffragments.Transformation:NEB5-alphaCompetentE.coli(HighEfficiency,NEB#C2987)providedwiththeNEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKitarerecommendedforuseforassembledproductsoflessthan15kb.ItisalsopossIBLetouseotherNEBcompetentE.colistrains,withtheexceptionofBL21,BL21(DE3),Lemo21(DE3),Nico(DE3),andSHuffle®.WhenusingcompetentE.colifromavendorotherthanNEB,wehavebeendecreasedrobustnessoftransformationwithhigh-fidelityDNAassembledproducts.Electroporation:Electroporationcanincreasetransformationefficiencybyseverallogs.WhenusingtheNEBuilderHiFIDNAAssemblyMasterMix,use1μloftheassembledproductforelectroporation,andplatemultipledilutions.ShouldyourequiretheuseofElectrocompetentcells,pleaseusethe"ElectrocompetentCellsTransformationProtocol"Biology:SomeDNAstructures,includinginvertedandtandemrepeats,areselectedagainstbyE.coli.SomerecombinantproteinsarenotwelltoleratedbyE.coliandcanresultinpoortransformationorsmallcolonies.蚂蚁淘电商平台
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公司简介
蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
淘搜索全球供应信息，找到合适的产品后在蚂蚁淘下单，然后蚂蚁淘的海外买手进行跨境采购、
运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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蚂蚁淘所有产品都是自运营的，我们已经跟国外多家厂方建立品牌推广合作关系, 获得对方的支持和授权； 同时客户可以通过订单详情查看到货物从厂方至客户的所有流程， 确保货物的来源； 正规报关，提供13%增值税发票。
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蚂蚁淘的价格是真实透明的，并且具有很大的价格优势，不需要繁杂的询价比价； 报价单与合同可以直接在线生成或打印；就像在京东购物一样， 您的鼠标点击几 次即完成在蚂蚁淘的采购，订单详情会告诉您所有进程。
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2021-07-21
本文对传统的PCR产物克隆方法进行简要介绍，然后针对目前市场上的克隆试剂盒类的产品进行介绍，对于选购提供一定的指导。 查看更多
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2021-08-29
深圳拜凯瑞科技有限公司在发布的分子克隆试剂盒供应信息，浏览与分子克隆试剂盒相关的产品或在搜索更多与分子克隆试剂盒相关的内容。 查看更多
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2021-09-15
InVitria公司产品介绍【代理商代购现货】 查看更多
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货号：290-66501 查看更多
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2019-04-04
北京义翘神州科技有限公司(Sino Biological Inc.)在发布的人 Fractalkine/CX3CL1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)供应信息，浏览与人 Fractalkine/CX3CL1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的产品或在搜索更多与人 Fractalkine/CX3CL1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的内容。 查看更多
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2020-03-16
北京义翘神州科技有限公司(Sino Biological Inc.)在发布的小鼠 TrkA/NTRK1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)供应信息，浏览与小鼠 TrkA/NTRK1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的产品或在搜索更多与小鼠 TrkA/NTRK1 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的内容。 查看更多
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2019-03-06
默瑞（上海）生物科技有限公司，Leica显微系统，Merk Millipore实验室纯水超纯水仪，Roche实时定量PCR仪，Partec流式细胞仪，RPA，TwistDx 代理商，Echelon代理商，Jackson代理商,KAPA，enzymatics经销商等,莫纳生物集团企业。 查看更多
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2021-09-17
Lexogen公司产品介绍【代理商代购现货】 查看更多
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2020-03-12
图尔思生物科技股份有限公司在发布的圖爾思 Swift PCR 克隆试剂盒供应信息，浏览与圖爾思 Swift PCR 克隆试剂盒相关的产品或在搜索更多与圖爾思 Swift PCR 克隆试剂盒相关的内容。 查看更多
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2021-06-03
Cisbio 利用其专利 HTRF 技术，研发了适用于基础科研、初筛、复筛的 Biomarker 检测解决方案，主要的应用分为以下几方面。 1. 炎症研究 2. 代谢疾病研究 3. cGMP 的测定 4. 其他可代替 ELISA 的 Biomarker 检测试剂盒 Biomarker 试剂盒的特点 ●可替代 ELISA ●操作简单，试验耗时少 ●一般无需洗涤过程，更适合自动化筛选 ●能微缩试验系统体积（特定情况下，最少可至 10ul 以下） ●有多 查看更多
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2021-09-01
上海吉凯基因化学技术有限公司在发布的cDNA克隆载体构建等一站式服务供应信息，浏览与cDNA克隆载体构建等一站式服务相关的产品或在搜索更多与cDNA克隆载体构建等一站式服务相关的内容。 查看更多
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2021-08-14
精准医疗时代，肺腺癌的治疗应首先检测 EGFR、ALK、ROS1 的突变 / 重排，基因异常的患者首选靶向治疗；美国 FDA 已批准克隆 22C3 免疫组化检测 PD-L1 肿瘤比例评分（TPS）≥ 50% 的患者使用帕姆单抗一线治疗，但是还不清楚二者是否可以同时存在。近日，哈佛医学院的 Deepa Rangachari 教授同时检测了肺腺癌患者的基因异常和 PD-L1 表达，结果发表在 JTO 上，让我们一起来看看！研究回 查看更多
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由cDNA全长怎么得到DNA全长? 分子生物 PCR相关 论坛...123
liuhua2021-09-05
mRNA模板经反转录酶催化体外反转录cDNA步骤应该与DNA复制程类似需要原料mRNA模板四脱氧核糖核苷酸逆转录酶能量注意：获DNA片段含非编码区序列专业答).构建cDNA文库：物细胞总mRNA模板用反转录酶合互补双链cDNA接载体转入宿主建立基文库cDNA文库1、mRNA提取及其完整性确定1）总RNA提取RNA提取：APGC或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA离高等真核物mRNA3'端均poly(A)尾总RNA通寡聚（DT）纤维柱离mRNA或利用磁珠制备纯mRNA某些情况裂解细胞用蔗糖梯度制备mRNA-核糖体复合物作提取mRNA替换途径3）mRNA纯化①按照总mRNA进行级主要用琼脂糖凝胶电泳蔗糖密度梯度离进行级；②聚核糖体免疫纯化利用抗体纯化合目肽4）mRNA完整性确定确定mRNA完整性三种：①直接检测mRNA；②测定mRNA转译能力；③检测总mRNA指导合cDNA第链能力2、cDNA合克隆1）cDNA第链合用亲层析mRNA根据mRNA3'端poly(A)尾结构原理用12~20核苷酸oligo（dT）与纯化mRNA混合oligo（dT）与poly(A)结合作反转录酶引物反转录反应产物条RNA-DNA杂交链oligo（dT）结合mRNA3'端合全cDNA需要反转录酶mRNA端移另端种全合难达尤其mRNA链建立种随机引物合cDNA随机引物种度6~10核苷酸由4种碱基随机组DNA片段与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合同mRNA同位点结合随机引物合产物RNA-DNA杂交体cDNA克隆载体前必须种杂交体RNA转变DNA链即形双链DNA2）.双链cDNA合合cDNA第二条链两种种利用cDNA第链3'末端现发夹环特征种发夹结构反转录酶第链末端返折并且进行复制第链结合cDNA第二链提供用引物用种合双链cDNA端发夹环用单链特异S1核酸酶切S1核酸酶处理修剪cDNA顺序使cDNA丢失mRNA5'端部顺序另种用肠杆菌RNaseH进行修饰RNaseH能识别RNA-DNA杂交并其RNA切割短片段些RNA短片段仍与cDNA第链结合新合DNA所取代新合DNA存切口用DNA连接酶些切口连接起形条完整DNA链RNaseH优于S1核酸酶能获包括mRNA5'端全部或绝部更顺序cDNA3）cDNA重组载体合cDNA与载体DNA进行连接般3种：①借助于末端转移酶3'-OH端合均聚物能力双链cDNA线性化载体DNA3'-OH端别加均聚核苷酸链；②双链cDNA线性化载体DNA别用Klenow片段进行末端补平用T4DNA连接酶进行齐连接形重组体；③通粘性末端连接4）.转化重组载体DNA定条件转化入肠杆菌形携带质粒菌株同重组DNA含同cDNA基整转化含自mRNA群体各种cDNA基转化群体构该mRNA全部遗传信息cDNA基文库5）.目cDNA克隆鉴定用于cDNA文库筛选鉴定目cDNA主要3种：①核酸杂交②免疫杂交检测③cDNA同胞选择
产品类别 SABC三步法试剂盒 | 博士德生物 BOSTER Biological...123
zhushuguang95212005-04-22
无缝克隆后平板不长菌落 分子生物 DNA重组 论坛学术...123
小胖06142021-08-14
一种重组慢病毒载体,2019nCoV假病毒及其制备和应用123
wanghm2008102021-07-29
什么基因组dna测序能发现许多新基因123
free1yi2021-09-15
于物基组应用克隆PCR基组测序芯片析DNA纯化都必经路选择佳纯化试剂盒却并非易事例您纯化基组DNA您需要试剂盒能温处理核酸同离质粒DNA且新代测序技术品要求颇高我需要些专门产品纯化DNA我介绍些新选择
盐沉淀
Epicentre（Illumina旗公司）MasterPure™ Complete DNA Purification Kit采用种专利盐沉淀系列试剂盒覆盖各种品类型包括血液、固定组织、植物、酵母、昆虫等短短30钟内带高产量核酸损失极少
据Epicentre资深产品经理Cristine Kinross介绍些试剂盒用户测序或其物应用品制备前需再进行额外纯化除蛋白及其细胞碎片引入些必须除毒性化合物避免洗涤并改善核酸产量
Kinross谈道：利用MasterPure收核酸色纯度让品直接进入测序文库制备于其应用包括芯片、qPCR克隆适合外试剂盒能用于RNA纯化获总核酸经DNase处理能总RNA
种试剂盒
Promega提供广泛核酸纯化试剂盒采用几种同策略例Wizard® Genomic DNA Purification Kit基于经典沉淀全血、组织培养细胞、物及植物组织、酵母细菌提取基组DNA灵高效；ReliaPrep™ 系列试剂盒采用柱提简单快速外Promega提供基于磁珠纯化试剂盒
Promega公司基组全球产品经理Eric Vincent表示：尽管溶液确切组同裂解、结合、洗涤洗脱基本程适用于同结合（硅胶或纤维素）同纯化形式（纯化柱或磁珠）及手自纯化操作于些非重要品类型（FFPE品）需要些专门操作或处理
我发独特结合/洗涤缓冲液能效除抑制游反应物质优化系统让研究员能够捕获少量核酸并体积（30 μl ）洗脱我发自化解决案适合各种试剂通量Vincent说
些试剂盒提供完整解决案能够极体积洗脱核酸同避免抑制剂残留洗脱液经些试剂盒纯化核酸用于PCR、Sanger测序、新代测序、芯片等游析
经典硅胶膜
QIAGEN核酸纯化试剂盒依赖DNA与纯化柱硅胶膜结合抑制剂洗掉完整DNA随柱洗脱产量高纯度高带更高质量新代测序文库
Marco Polidori - QIAGEN本制备全球产品经理 - 认处理极少量品或困难品FFPE高产量变格外关键FFPE品所产DNA能现随机胞嘧啶脱氨事件导致单核苷酸态性（SNP）QIAGENGeneRead DNA FFPE Kit能够除脱氨胞嘧啶避免NGS实验产错误结产品尚未式推若兴趣试用填写资料
我部试剂盒都已NGS应用证明循环肿瘤DNA全基组测序微物组Polidori谈道些试剂盒能让用户各种品获高质量DNA避免FFPE品现C-T假象并短间内带高量DNAMagAttract HMW DNA kit能够利用简单磁珠操作实现100-200 kb DNA纯化整纯化程温除污染物及抑制剂并具极高产量纯度
离液盐
Sigma-Aldrich公司提供GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit基于离液盐试剂产品含离液盐溶液品裂解确保彻底变性添加乙醇让DNA与硅胶膜结合污染物洗掉DNA洗脱Tris缓冲液
通专离基组DNA选择硅胶膜试剂盒让用户能够各种品纯化高质量DNA包括培养细胞、组织（包括鼠尾）、新鲜全血或白细胞
据介绍试剂盒综合硅胶膜结合微量离形式处避免昂贵树脂、乙醇沉淀及害机物苯酚、氯仿更重要纯化所DNA应用于限制性内切酶消化、PCR、Southern blot、测序等
（作者：James Netterwald/物通编译）
盐沉淀
Epicentre（Illumina旗公司）MasterPure™ Complete DNA Purification Kit采用种专利盐沉淀系列试剂盒覆盖各种品类型包括血液、固定组织、植物、酵母、昆虫等短短30钟内带高产量核酸损失极少
据Epicentre资深产品经理Cristine Kinross介绍些试剂盒用户测序或其物应用品制备前需再进行额外纯化除蛋白及其细胞碎片引入些必须除毒性化合物避免洗涤并改善核酸产量
Kinross谈道：利用MasterPure收核酸色纯度让品直接进入测序文库制备于其应用包括芯片、qPCR克隆适合外试剂盒能用于RNA纯化获总核酸经DNase处理能总RNA
种试剂盒
Promega提供广泛核酸纯化试剂盒采用几种同策略例Wizard® Genomic DNA Purification Kit基于经典沉淀全血、组织培养细胞、物及植物组织、酵母细菌提取基组DNA灵高效；ReliaPrep™ 系列试剂盒采用柱提简单快速外Promega提供基于磁珠纯化试剂盒
Promega公司基组全球产品经理Eric Vincent表示：尽管溶液确切组同裂解、结合、洗涤洗脱基本程适用于同结合（硅胶或纤维素）同纯化形式（纯化柱或磁珠）及手自纯化操作于些非重要品类型（FFPE品）需要些专门操作或处理
我发独特结合/洗涤缓冲液能效除抑制游反应物质优化系统让研究员能够捕获少量核酸并体积（30 μl ）洗脱我发自化解决案适合各种试剂通量Vincent说
些试剂盒提供完整解决案能够极体积洗脱核酸同避免抑制剂残留洗脱液经些试剂盒纯化核酸用于PCR、Sanger测序、新代测序、芯片等游析
经典硅胶膜
QIAGEN核酸纯化试剂盒依赖DNA与纯化柱硅胶膜结合抑制剂洗掉完整DNA随柱洗脱产量高纯度高带更高质量新代测序文库
Marco Polidori - QIAGEN本制备全球产品经理 - 认处理极少量品或困难品FFPE高产量变格外关键FFPE品所产DNA能现随机胞嘧啶脱氨事件导致单核苷酸态性（SNP）QIAGENGeneRead DNA FFPE Kit能够除脱氨胞嘧啶避免NGS实验产错误结产品尚未式推若兴趣试用填写资料
我部试剂盒都已NGS应用证明循环肿瘤DNA全基组测序微物组Polidori谈道些试剂盒能让用户各种品获高质量DNA避免FFPE品现C-T假象并短间内带高量DNAMagAttract HMW DNA kit能够利用简单磁珠操作实现100-200 kb DNA纯化整纯化程温除污染物及抑制剂并具极高产量纯度
离液盐
Sigma-Aldrich公司提供GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit基于离液盐试剂产品含离液盐溶液品裂解确保彻底变性添加乙醇让DNA与硅胶膜结合污染物洗掉DNA洗脱Tris缓冲液
通专离基组DNA选择硅胶膜试剂盒让用户能够各种品纯化高质量DNA包括培养细胞、组织（包括鼠尾）、新鲜全血或白细胞
据介绍试剂盒综合硅胶膜结合微量离形式处避免昂贵树脂、乙醇沉淀及害机物苯酚、氯仿更重要纯化所DNA应用于限制性内切酶消化、PCR、Southern blot、测序等
（作者：James Netterwald/物通编译）
启动子(Promoters)克隆方法研究进展123
骗精算了2602021-08-03
启没cDNA文库,genomic DNA,用DNA模板才能扩
脑脊液寡克隆带电泳,海伦娜的试剂盒.哪位高手知道它的影响因素？_...123
dearlily2021-08-29
相关疾病：先天性卵巢发育不全综合征我们用美国海伦娜的试剂盒,等电聚焦法测CSF-OCB,跑出的胶总是不平整,导致转膜不好.700V,电...
【求助】关于RNA干扰技术的问题 核酸基因技术123
whitley2021-08-09
各位大侠，俺正在准备用雪旺细胞做RNA干扰，但俺是个菜鸟，对此技术以及质粒克隆技术一窍不通，俺看了些资料，有些问题不太明白，请各位大侠不吝赐教：
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
什么是RACE技术?采用RACE技术如何克隆得到基因的cDNA全长...123
浪人TA421002021-09-02
末端扩增技术包括5端扩增3端扩增般需要用含已知序列接通巢式PCR目产物克隆测序目基片段组装全通5端难度较3端
【求助】关于中期染色体FISH探针的长度问题,恳请有相关经验的同行...123
恋南国花锦2021-08-16
我实验当中要用到荧光探针来定位某条中期染色体，这个探针是这个染色体上的特定单拷贝序列，如果我自己要设计探针找公司合成的话，请问下大家这个探针的长度至少要多长？（采用间接标记的方法）望大家不吝赐教，谢谢！
人白细胞介素10(hIL10)cDNA克隆与表达的研究123
安诺瑞康2021-09-13
白细胞介素10（IL-10）是一种由多种细胞亚群产生的重要免疫调节因子。
早期研究显示，其主要生物功能为限制炎症反应及调节多种免疫细胞的分化和增殖，例如：T细胞、B细胞、NK细胞、
抗原呈递细胞、肥大细胞、粒细胞等。近来研究结果提示，IL-10也可以介导免疫反应的激活，有助于清除感染及非感染
颗粒且只产生轻微的炎症反应。大量的研究，包括患者IL-10的表达分析、体外实验及动物实验表明，IL-10与自身免疫
性疾病、炎症、肿瘤等疾病的发生、发展关系密切。临床试验主要集中于RA、炎症性肠病、银屑病、器官移植和丙型肝
炎等。虽然试验结果各不相同，但是使我们对IL-10在免疫反应中的作用的认识更加深入，同时也预示IL-10可以成为一
种治疗药物。目前，我国还没有重组基因工程IL-10药物上市，而且在探索如何高效表达具有生物活性rhIL-10的研究尚
处于起步阶段。本研究建立在国内外IL-10重组基因工程研究基础上，拟克隆人IL-10基因，通过原核、真核两种表达系
统表达IL-10蛋白，奠定重组基因工程研制人IL-10的基础。主要研究结果如下：一、依据Genbank中人类IL-10序列设计
一对特异性引物，应用RT-PCR技术，从LPS刺激的外周血单个核细胞中成功地克隆出hIL-10成熟肽编码序列，并将之克
隆入pGEM-T载体，构建出中间载体<WP=91>pGEM-T-hIL-10，转化入大肠杆菌JM109中，经酶切鉴定及序列测定与
分析，与GenBank中发表的（NM000572.2）hIL-10成熟肽编码序列完全一致。为hIL-10基因的表达研究奠定了基
础。二、从中间载体pGEM-T-hIL-10中将hIL-10成熟肽编码序列酶切回收，定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)的T7
启动子下游，成功地构建了原核表达载体pET-28a(+)-hIL-10，将表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLyss中获得表达
菌株，经IPTG的诱导获得较高表达，表达蛋白以包涵体形式存在。经薄层扫描确定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的
28.7%。Westernblotting分析结果显示，表达产物与抗hIL-10单克隆抗体呈特异性阳性反应。产物经固相金属离子亲
和层析方法初步纯化，并在柱上应用浓度递减的尿素缓冲液对产物进行复性。活性研究结果表明，复性产物具有抑制
LPS刺激的外周血单核细胞表达MHCⅡ分子的活性。三、为了进一步获得高活性、高表达、适用于产业化生产的rhIL-
10，本研究选择应用酵母表达系统对hIL-10进行表达。应用PCR方法从pGEM-T-hIL-10扩增出hIL-10成熟肽编码序
列，并在其上下游分别引入EcoRI和BaxⅠ两个酶切位点，通过定向克隆成功地构建出分泌型酵母表达载体pPICZαA-
rhIL-10。采用电穿孔技术将表达单位转化入酵母菌P.pastorisX-33中，通过提取酵母基因组进行PCR鉴定以及
MD/MM营养表型筛选，初步筛选出10株可表达具有hIL-10活性的酵母菌。小量发酵培养表达菌株，以0.5%甲醇诱导
96小时，培养上清中蛋白经硫酸铵沉淀后，经SDS-PAGE、薄层扫描显示rhIL-10约占样品蛋白总量的10%。产物经固
相金属离子亲和层析方法初步纯化，纯度达94%。活性研究结果显示酵母表达的分泌型rhIL-10具有较原核表达产物更高
的活性。
逆转录酶需要_完美作业网_www.wanmeila.com123
Shine_former2021-09-08
病毒DNA注入宿主细胞所需酶类都DNA指导利用宿主细胞原料合
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