
Pre-madelentivialparticles expresshumancodonoptimizedwild-type Cas9endonuclease under anenhanced EF1apromoter, withourproprietaryNLS (NuclearLocalizationSignal)atitsN-terminal,forthebestnuclearpenetration.Italsocontainsa GFP-Blasticidin fusiondualMarker(underRSVpromoter)forselectionofthetransducedcellsviaGFPfluorescentsignalorviaBlasticidinantibiotic.Thefluorescentsignalprovidesareal-timemonitoringofthelentivirus’transductionefficiencyinyourcelltypes.
SeeProductManual here (.pdf).
Application:usedforCRISPRgeneediting(Note:usedwitha separate “genespecificgRNA lentivirus”or”genespecificgRNAvector”forCRISPR editing )
Amount: 5x106IFU/mlx200ulinDMEMmedium with10%FBS,60ug/ml polybrene.
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Cat#:LVP710
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双杂交系统另重要元件报道株报道株指经改造、含报道基(reporter gene)重组质粒宿主细胞用酵母细胞 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点: 〈1〉 易于转化、便于收扩增质粒〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达(lacZ) 析蛋白间结合作用
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用 具高度敏性主要由于:①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强 者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
用pGBKT7酵母双杂交系统交换
二、噬菌体展示技术:编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术:表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术:荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术:蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术:免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物:目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷:两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术:蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
最近本人在做一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的酵母双杂交,想吊出它的互作基因,前段时间用Invitrogen的PROQUESTTWO-HYBRIDSYSTEM筛过一次库,没有得到任何阳性克隆,我估计是连入载体的基因太长有3KB多,1000多个氨基酸,可能就算表达出来了也不能行使正常功能。随后取了蛋白的激酶区1.8KB,想重新筛一次库(还未开始重筛)。后来老板的建议是要我试试酵母细胞质双杂交系统,因为在生物体内,我所研究的蛋白是在细胞质中表达的,可能在酵母细胞核中也不能正常工作(猜测)。
这两天我查了查,发现细胞质的双杂交完全不同,要是做的话还有重新购买另外的试剂盒,重新构建文库。
还有一点就是,前人发表的文章,同样是做我这种蛋白激酶的,都是用传统的酵母双杂交系统筛选到互作蛋白的,如果情况是这样的话我是否还有必要尝试细胞质的双杂交呢?
还是等我做了激酶区的筛库之后再说?
请各位帮忙看看,谢谢。
2.诱饵质粒转化缺乏报告基启酵母细胞株选择转化酵母;
3.再文库质粒转化酵母;
4.通报告基功能筛选相互作用蛋白图" class="ikqb_img_alink">
主要由于:
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
THEGFPTWO--HHYBRIDYBRIDSYSTEM.pdf(126.79k)
词典
转录激
双语例句
1
Transcriptional activation and repression regulation in target gene by thyroid hormone receptors
甲状腺激素受体调节靶基转录激抑制作用
2
Objective: To assay the transcriptional activation effect of prohibitin in yeast two hybrid system.
目:检测抗增殖蛋白酵母双杂交系统否具转录自激作用

