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2021-09-11
这一部分介绍了一种原位 PCR，特别是逆转录酶原位 PCR 的简略方法。详细讨论了其中的每个实验程序。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。 查看更多
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2018-12-26
The following protocol is designed for subcloning inserts (I) from one vector into another vector (V). The inserts can be anywhere from 30 bp to 8 kb (possibly 查看更多
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2021-07-26
原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 查看更多
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2021-09-06
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。实验目的是掌握PCR原理，学习PCR操作过程 查看更多
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2021-08-09
随着转基因农作物的大量种植，其安全性问题也日益受到人们的重视。2002年我国要求对转基因农作物实行标签管理。抗草甘膦（glyphosate）大豆 （商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有 800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。目前采用PCR检测转基因大豆的方法大多是采用琼脂糖 查看更多
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2018-11-28
GenHunter Corporation公司产品介绍【代理商代购现货】 查看更多
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2018-11-27
OZ Biosciences公司产品介绍【代理商代购现货】 查看更多
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2021-08-18
限制性内切核酸酶介导的差异显示（RMDD）实验的相关实验步骤、实验技巧、实验protocol、实验经验及常见问题。<link rel="stylesheet" type="text/css" href="/ueditor... 查看更多
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2018-08-07
尽管整合性转化的频率很低，但可以通过与整合位点同源的克隆化基因内的限制性位点将质粒线性化以提高转化效率。得到的整合体含有完整的质粒，两侧为基因的完整拷贝。 查看更多
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2018-11-28
Primerdesign公司产品介绍【代理商代购现货】 查看更多
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2021-09-02
端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。 查看更多
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2021-09-16
在本方案所描述的反应中，差异 DNA 被选择性地扩增。每个实验至少应该有 4 个反应：①已消减的检测 DNA;②未消减的检测者对照（1-c);③反向消减的检测 DNA;④反向未消减的对照（2-c)。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。 查看更多
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DNA转录合成mRNA后,内含子会被切掉.那启动子和转录子那段也会...123
jgc952021-08-01
WB试验常见问题解答123
yawenjilin2021-07-28
我现在要用bac克隆自己标记成探针做人类染色体水平的fish，以确定染色体的具体断裂位置。
现在已经把bac克隆的质粒DNA提取出来了，但是在标记探针前，有以下几个疑问：
1：提取出的质粒DNA是否需要通过测序等方法进行验证该克隆的准确性？
2：是否需要把bac克隆的DNA从载体上酶切下来？如果酶切，UCSC数据库中提供的两侧序列末端的酶切位点就是吗？如果不用酶切，那载体片断在探针标记时会不会一同标记上从而影响后续试验结果？
3：在探针标记前，酶切或不酶切得到的bac克隆DNA是否需要进一步纯化？用普通的琼脂糖电泳切胶回收纯化就可以吗？那所用的切胶回收试剂盒应该是哪种的呀？
4：像我这种自己标记好探针，在作fish时，有现成的试剂盒吗？
第一次做fish，有好多不是很清楚的地方，查阅大量文献中也只是提供其中几个关键步骤，希望有经验的朋友提供宝贵意见，给与指导。
非常感谢！！！
现在已经把bac克隆的质粒DNA提取出来了，但是在标记探针前，有以下几个疑问：
1：提取出的质粒DNA是否需要通过测序等方法进行验证该克隆的准确性？
2：是否需要把bac克隆的DNA从载体上酶切下来？如果酶切，UCSC数据库中提供的两侧序列末端的酶切位点就是吗？如果不用酶切，那载体片断在探针标记时会不会一同标记上从而影响后续试验结果？
3：在探针标记前，酶切或不酶切得到的bac克隆DNA是否需要进一步纯化？用普通的琼脂糖电泳切胶回收纯化就可以吗？那所用的切胶回收试剂盒应该是哪种的呀？
4：像我这种自己标记好探针，在作fish时，有现成的试剂盒吗？
第一次做fish，有好多不是很清楚的地方，查阅大量文献中也只是提供其中几个关键步骤，希望有经验的朋友提供宝贵意见，给与指导。
非常感谢！！！
cDNA文库与基因组文库有什么不同_123
忻忻相惜3462021-08-26
基因组DNA文库含有一种生物的全部基因，从基因组文库中获得的基因是完整的
cDNA文库含有一种生物的部分基因，cDNA本质就是外显子
基因组文库大，其中基因含有启动子和内含子
cDNA文库小，没有内含子和启动子
cDNA文库含有一种生物的部分基因，cDNA本质就是外显子
基因组文库大，其中基因含有启动子和内含子
cDNA文库小，没有内含子和启动子
【求助】如何设计整个基因的克隆引物？ 实验方法123
沐夕36524柯绽2021-08-08
序列前保留200bp
设计引物候引物度设置25-27左右
设计引物候引物度设置25-27左右
primer克隆基因怎样改克隆长度123
胖褂岗292021-08-09
primer克隆基改克隆度
百度搜索NCBI gene想查找基名称输入搜索接现表格选择要查找基（主要选择物种）接页面找基各种亚型应mRNA序列编号点进串信息找CDS点页面mRNA序列显示CDS序列
物芯片高密度固定固相支持介质物信息微列阵列阵每序列及位置都已知并按预先设定顺序点阵基芯片物芯片种其固定核算类物质主要用于DNA、RNA析DNA芯片微点阵两种
离目基指基组发现或找某目（标）基目前通①比较同物种间或同物种同体间；或同体同发育期或同环境条件基差异表达（基表达平行析）实现采用基芯片技术进行基差异表达研究通杂交直接检测细胞mRNA种类及丰度与传统差异显示相比具品用量自化程度高检测目标DNA密度及并行种类等优点②利用同源探针cDNA或EST微列阵筛选离目基目前DNA 芯片、cDNA芯片两种其基本步骤包括：基芯片制备、靶品制备、杂交与检测、目基离并获全
百度搜索NCBI gene想查找基名称输入搜索接现表格选择要查找基（主要选择物种）接页面找基各种亚型应mRNA序列编号点进串信息找CDS点页面mRNA序列显示CDS序列
物芯片高密度固定固相支持介质物信息微列阵列阵每序列及位置都已知并按预先设定顺序点阵基芯片物芯片种其固定核算类物质主要用于DNA、RNA析DNA芯片微点阵两种
离目基指基组发现或找某目（标）基目前通①比较同物种间或同物种同体间；或同体同发育期或同环境条件基差异表达（基表达平行析）实现采用基芯片技术进行基差异表达研究通杂交直接检测细胞mRNA种类及丰度与传统差异显示相比具品用量自化程度高检测目标DNA密度及并行种类等优点②利用同源探针cDNA或EST微列阵筛选离目基目前DNA 芯片、cDNA芯片两种其基本步骤包括：基芯片制备、靶品制备、杂交与检测、目基离并获全
编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定实验 实验方法 ...123
小锋4912021-08-29
难需要看蛋白纯化工艺DNA处理
举例言目前家药典条宿主DNA残留检测
举例言目前家药典条宿主DNA残留检测
设计克隆表达引物一定要从ATG和TAG开始吗？ 分子生物 ...123
wrongdna2021-08-19
请教在一般情况下要克隆一个真核生物的蛋白质编码基因从而得到该蛋白质产物，是要从信号肽开始还是直接从成熟肽开始，为什么？还请赐教!
EST序列的基因克隆 123
颜魅家族Gj2021-08-15
利用计算机协助克隆基称电基克隆（sillcon cloning）与定位克隆、定位候选克隆策略并列即采用物信息延伸EST序列获基部乃至全cDNA序列EST数据库迅速扩张已经并继续导致识别与克隆新基策略发革命性变化
4.1
EST序列获取
利用计算机协助克隆第步必须获兴趣ESTdbEST数据库找EST途径寻找同源序列标准：度≥100bp同源性50%、85%通数万维网界使用BLAST检索程度实现其用NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank、意利TigemESTmachine（包括EST提取者EST组装机器）、THC（Tentative Human Consensus Sequences）数据库、ESTBlast检索程序——通英类基组作图项目资源（Human Genome Mapping Project Resource CenterHGMP—RC）服务器访问检序列组装重叠群（contig）重叠群检序列重复进行BLAST检索与序列组装延伸重叠系列重复程直没更重叠EST检或者说重叠群序列能继续延伸获全基编码序列获些EST序列数据再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测假凤精确匹配基EST序列数据据EST六种阅读框翻译蛋白质接着与蛋白质序列数据库进行比较析基析结致三种：第已知基研究象类已鉴定解基；第二前未经鉴定新基；第三未知基部基间同种或异种基匹配新基未知基进步用于物研究
4.2
基电定位
基电定位采用NCBI电PCR程序进行检索寻找EST序列否存序列标签位点（sequence tagged sites,STS）STS作基组单拷贝序列新代遗传标记系统其数目覆盖密度较达平均每1kbSTS或更密集寻找STS与相应染色体相比较即序列定位该染色体
4.3
IMAGE克隆索取
许ESTs所应cDNA克隆通基组及其表达整合析（intergrated molecular analysis of genomes and their expressionIMAGE）协定免疫索取与电基克隆相辅相IMAGE协定由美LLNL家实验室主持宗旨共享排列cDNA文库克隆重规模EST测序项目Merk&Cow公司投资类ESTs项目等都加入IMAGE协定研究者通另外途径基部序列并通同源性检索发现该片段与加入IMAGE协定EST序列高度同源便免费索取其原始克隆通美ATCC组织（American Type Culture Collection）索取避免或减轻筛选全基麻烦集精力进行基功能研究图" class="ikqb_img_alink">
4.1
EST序列获取
利用计算机协助克隆第步必须获兴趣ESTdbEST数据库找EST途径寻找同源序列标准：度≥100bp同源性50%、85%通数万维网界使用BLAST检索程度实现其用NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank、意利TigemESTmachine（包括EST提取者EST组装机器）、THC（Tentative Human Consensus Sequences）数据库、ESTBlast检索程序——通英类基组作图项目资源（Human Genome Mapping Project Resource CenterHGMP—RC）服务器访问检序列组装重叠群（contig）重叠群检序列重复进行BLAST检索与序列组装延伸重叠系列重复程直没更重叠EST检或者说重叠群序列能继续延伸获全基编码序列获些EST序列数据再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测假凤精确匹配基EST序列数据据EST六种阅读框翻译蛋白质接着与蛋白质序列数据库进行比较析基析结致三种：第已知基研究象类已鉴定解基；第二前未经鉴定新基；第三未知基部基间同种或异种基匹配新基未知基进步用于物研究
4.2
基电定位
基电定位采用NCBI电PCR程序进行检索寻找EST序列否存序列标签位点（sequence tagged sites,STS）STS作基组单拷贝序列新代遗传标记系统其数目覆盖密度较达平均每1kbSTS或更密集寻找STS与相应染色体相比较即序列定位该染色体
4.3
IMAGE克隆索取
许ESTs所应cDNA克隆通基组及其表达整合析（intergrated molecular analysis of genomes and their expressionIMAGE）协定免疫索取与电基克隆相辅相IMAGE协定由美LLNL家实验室主持宗旨共享排列cDNA文库克隆重规模EST测序项目Merk&Cow公司投资类ESTs项目等都加入IMAGE协定研究者通另外途径基部序列并通同源性检索发现该片段与加入IMAGE协定EST序列高度同源便免费索取其原始克隆通美ATCC组织（American Type Culture Collection）索取避免或减轻筛选全基麻烦集精力进行基功能研究图" class="ikqb_img_alink">
辩论稿:克隆的好处与坏处123
梅桂华丽2021-09-01
克隆许优点：
1）克隆技术减轻些能母亲性痛苦
2）克隆实验实施推遗传发展制造物器官移植辟前景
3）克隆技术用于治疗神经系统损伤神经组织再干细胞修复神经损伤
克隆许缺点避免： 1）克隆技术干扰自演化程
2）克隆技术种昂贵技术需要量资金物专业参与失败率高
3）克隆技术应用于体导致代遗传性状工控制4）克隆技术用于创建超或强壮体魄智力迟钝外克隆技术效使用类遗传男性失意义
所说科技双刃剑优点缺点并没标准答案看着使用
1）克隆技术减轻些能母亲性痛苦
2）克隆实验实施推遗传发展制造物器官移植辟前景
3）克隆技术用于治疗神经系统损伤神经组织再干细胞修复神经损伤
克隆许缺点避免： 1）克隆技术干扰自演化程
2）克隆技术种昂贵技术需要量资金物专业参与失败率高
3）克隆技术应用于体导致代遗传性状工控制4）克隆技术用于创建超或强壮体魄智力迟钝外克隆技术效使用类遗传男性失意义
所说科技双刃剑优点缺点并没标准答案看着使用
克隆基因总克隆不出,为什么 123
鬼鬼令尊丶囧傤2017-11-01
高等物基组克隆完整基 真核物与原核物启同且真核物基通间隔基即外显内含相间排列真核物完整基直接转入肠杆菌没用相应启能启mRNA转录且内含能确剪切
【转贴】世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在吉林大学诞生...123
longjlau2021-09-02
世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在吉林大学诞生
[党务办公室][发布人:李荣茂][阅读357次][2008-9-1016:25:18][修改][删除][打印]
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9月9日下午5时40分，世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在吉林大学农学部诞生。这标志着人类首次培育的“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”获得了成功。
9月9日下午5时40分至7时10分，在吉林大学原种猪场，三头“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”先后顺利诞生，体重分别为1050克、1100克和550克。
猪瘟是一种严重威胁养猪业的传染病。为了培育出能够抗猪瘟病毒的猪，以吉林大学农学部畜牧兽医学院赖良学教授为首席专家和军事医学科学院军事兽医研究所的专家共同组成的课题组，在国家自然科学基金资助的基础上，经过近两年时间的协作攻关，将能抑制猪瘟病毒的基因转染到“中国实验小型猪”胎儿成纤维细胞内，并以此体细胞进行核移植制备猪克隆胚胎，将此胚胎移植到杜洛克代孕母猪体内，怀孕114天后顺利产出三头健康的克隆仔猪。经对仔猪体细胞进行基因检测，证实该克隆猪的细胞带有所转入的抗猪瘟病毒基因。进一步的抗病毒检测实验正在进行中。这三头克隆猪的诞生标志着我国在转基因猪抗病育种研究领域已经达到了国际领先水平。
[党务办公室][发布人:李荣茂][阅读357次][2008-9-1016:25:18][修改][删除][打印]
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9月9日下午5时40分，世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在吉林大学农学部诞生。这标志着人类首次培育的“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”获得了成功。
9月9日下午5时40分至7时10分，在吉林大学原种猪场，三头“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”先后顺利诞生，体重分别为1050克、1100克和550克。
猪瘟是一种严重威胁养猪业的传染病。为了培育出能够抗猪瘟病毒的猪，以吉林大学农学部畜牧兽医学院赖良学教授为首席专家和军事医学科学院军事兽医研究所的专家共同组成的课题组，在国家自然科学基金资助的基础上，经过近两年时间的协作攻关，将能抑制猪瘟病毒的基因转染到“中国实验小型猪”胎儿成纤维细胞内，并以此体细胞进行核移植制备猪克隆胚胎，将此胚胎移植到杜洛克代孕母猪体内，怀孕114天后顺利产出三头健康的克隆仔猪。经对仔猪体细胞进行基因检测，证实该克隆猪的细胞带有所转入的抗猪瘟病毒基因。进一步的抗病毒检测实验正在进行中。这三头克隆猪的诞生标志着我国在转基因猪抗病育种研究领域已经达到了国际领先水平。
获得一个未知的基因的核苷酸系列后,你如何对其功能进行初步预测？...123
煞TAe72017-11-01
基克隆需要烟草内验证功能
基克隆利用体外重组技术,特定基其DNA顺序插入载体基克隆主要目标识别、离特异基并获基完整 全序列,确定染色体定位,阐明基化功能,明确其特定性状遗传控制关系通几十努力由于植物发育,理化,遗传等科迅速发展,使 掌握量关植物优良性状基物遗传知识,再运用先进酶物技术已经克隆与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育关许基我实验室麻抗真菌蛋白基作功能克隆研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),克隆植物基探讨 其克隆,本文论述基克隆策略、及取些进展
1 功能克隆(functional Cloning)
功能克 隆根据性状基本化特性功能信息,鉴定已知基功能克隆(Collis,1995)其具体作:纯化相应编码蛋白构建 cDNA文库或基组文库,DNA文库基筛选根据情况主要用二种办进行,(1)纯化蛋白质进行氨基酸测序,据合寡核苷酸探针cDNA 库或基组文库筛选编码基,(2)相应编码蛋白制相应抗体探针,cDNA入载体表达库筛选相应克隆功能克隆种经典基克隆策略, 基离利用种策略
Hain等葡萄克隆两编码白藜芦醇合二苯乙烯合酶基(Vst1Vst2),葡萄抗菌化合 物白藜芦醇存,提高灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)抗性,烟草其些植物二苯乙烯合酶,克隆该基经转基,些植物产灰质葡萄孢抗性意义(Hain 等,1985)Kondo等1989编码水稻巯基蛋白酶抑制剂基组DNA做克隆序列析(Kondo等,1989)周兆斓等构建水稻 cDNA文库,离编码水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA(周兆斓等,1996)植物蛋白酶抑制剂类抗虫物质,抑制摄食害虫蛋白质消 化,使害虫缺乏所需氨基酸导致非发育或死亡胡华等烟草离流行于我黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆编码该病毒外壳蛋白cDNA基(胡华等,1989)王春香等病烟草叶片离纯化马铃薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆完整马铃薯x病毒外壳蛋白基,并外壳蛋白基转入马铃薯,期获抗pvx病毒栽培种马铃薯(王春香等,1991)病毒外壳 蛋白(Coat protein cp)基功克隆,使转基植物产病毒外壳蛋白基介导抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导抗性Van kan 报道真菌功克隆毒基Avr9,直接利用基介导广谱高效基工程植物(Van Kan等,1991)我1995构建麻cDNA文库,制备抗体探针功离编码麻抗真菌蛋白基cDNA克隆,抗真菌基农业、医 药等面应用打基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)功能克隆特点用基表达产物蛋白质克隆基、虽某性状编码基未 知其理化及代谢途径研究比较清楚,离纯化控制该性状蛋白质功能克隆关键离纯度高蛋白质要纯 蛋白质,十特异探针,策略行效采用功能克隆虽已经克隆基,由于绝数基产物目前知道所数基 难用经典克隆随着物技术发展,条新基克隆策略逐渐形,定位克隆
2 定位克隆(Positional cloning)
根据遗传连锁析,染色体步移基定位染色体具体位置断缩筛选区域进克隆该基,研究该基功能或抗性化机制,种策略 叫定位克隆(Monaco,1994)连锁析即通基与DNA标记间重组系数估计两者间距离,若某种性状基与DNA标记代 离,即连锁起趋势根据原理与已知某DNA标记连锁基染色体定位由于连锁析需要依赖特定基作连锁标记,即标记基 与待研基间存连锁关系,满足与待研基相连锁基实太少,所连锁析克隆数基存着定困难RFLP现使态性基标记存 于整基组内,解决连锁析难克服困难
1980Wyman等科家首建立限制酶切片段度态性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使任何种表型相关基定位能限制酶切片段度态性用限制性内切酶切割产DNA片段度态性呈 孟德尔式遗传,存于全基组独特态标记,RFLP使基定位变易行(Wyman等,1980)目前定位克隆般用RFLP等标记制作 遗传图谱,寻找与待测基连锁RFLP标记,获基染色体定位克隆基所RFLP发展起RAPD技术建立,待测基相 准确定位,利用已知基离与连锁未知基其基本程序构建基组文库、用已知A基探针,基组文库筛选与其同源序列 a克隆,再用a克隆探针基组文库筛选与a克隆同源序列b克隆,类推筛选未知基并离目前已番茄、烟草、麦、 水稻、豆、玉米等植物发现与抗病基紧密连锁RFLP标记并构建遗传图谱(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)用种已别克隆拟南芥菜、番茄、水稻等植物关抗病基(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) Martin等1993早用定位克隆技术克隆番茄pto基,pto基负责带毒基Avrpto细菌,丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株抗性,Pto基导入病番茄转基植株增强病原菌抗性(Martin等,1993)Wenyuan等1995用技术克隆 水稻Xa21基,Xa21基真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具抗性(Wenyuan等,1995)
3 转座标记(transposon tagging)
转座 基位置转移另位置DNA片段转座程原位置DNA片段(转座)并未消失,发转移转座拷贝、基发转座引起插入突 变使插入位置基失并诱导产突变型或插入位置现新编码基通转座标记基(抗药性等)检测突变基位置克隆突变基 转座标记转座作基定位标记通转座染色体插入嵌合克隆基(Fedoroff等,1984;Jones等, 1994)
利用转座克隆植物基操作步骤主要应几面:(1) 已离转座与选择标记构建含转座质粒载体(2) 转座导入目标植物(3) 利用Southern杂交等技术检测转座否载体质粒转座目标植物基组,转座定位离目标基所缺少(4) 转座插入突变鉴定及其离(Ellis等,1992)通用于克隆植物基转座玉米Ac. Mu, SmpDs等Ac含编码转座酶基,能够自主转座,Ds含转座酶所能自主转座,Ds-Ac系统AcDs提供转座酶自主 转座用转座标记进行植物基离,首要Ac等转座转化要进行基克隆植物,目前数利用土壤农杆菌介导转化系统转座导入 目标植物(Keller等,1993;Bancroft等,1993)目前已玉米、烟草、番茄、亚麻等植物克隆抗性基(Johal Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)JohalBrigge离抗灰色 蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号种玉米HMI特异真菌抗性基该基存于玉米抗性品种,能够解蠕孢1号种产玉米具特异致病性HC毒素, 该基编码HC毒素脱毒酶使植物具抗病性(JohalBriggs,1992)转座标记原理相似T-DNA标记,两者都由于 段基插入导致染色体结构发变化产突变体,T-DNA标记产突变由于T-DNA插入导致Kenneth等利用T-DNA插入标记培育 拟南芥矮化突变体(Kenneth等,1989)
4 工合并克隆基
蜘蛛毒素种肽,37氨基酸,体外实 验表明能杀死种农作物害昆虫,蒋红等1995根据蜘蛛毒素氨基酸序列,采用植物偏密码、工合并克隆肽基(蒋红等, 1995)Adang 1995工合苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基(Adang等,1995)
5 表型克隆(phenotype cloning)
1995JonssonWeissman提表型克隆概念(JonssonWeissman,1995),些植物目前即解基产物,没 进行基定位,已知植物表型存差异,利用表型差异或组织器官特异表达产差异克隆植物基表型克隆San等用表型差异拟南芥 克隆赤霉素合酶基(Sun等,1992)表型克隆策略试图表型与基结构或基表达特征联系起,离特定表型相关基,力求必 事先知道基化功能或图谱定位根据基表达效应直接离该基(Brown,1994)
6 mRNA差异显示(mRNA differential display)
1993LiangAverboukh 等科家提mRNA差异显示(mRNA DD, mRNA differential display)案(Liang等,1993)案依据高等真核物所命程病理变化,论由单基控制由基控制 ,终都通基表达质或量差异体现研究基表达差异,研究两基组差异表达基离,克隆复杂性状相关基辟重要途径该 案检测、离全任何部突变mRNA,其基本程序:(1)提取两种细胞mRNA,反转录2种cDNA(2) 定引物作随机聚合酶链反应(3) 通扩增产物电泳析,离同品间差异条带(4)差异DNA做探针(5) cDNA文库或基组文库筛选基并作功能析(Baeur等,1993)LiangPardee建立mRNA差别显示PCR (LiangPardee,1992),该同析几品间基表达,检测灵敏度高,PCR扩增,些表达量低mRNA能检测 ,应用PCR及DNA测序两种技术简单易行,目前已功用离麦热激蛋白基(Joshi等,1996)水稻蔗糖调节基(Tseng等, 1995)等
7 减杂交(Subtractive hybridization)
Lee等1991提减杂交技术 (Lee等,1991),植物发育程同组织或同组织同发育阶段,由于基特异性表达,其mRNA表现同,表达特异基组织 提取 mRNA,反转录cDNA,特异基表达组织提取mRNA,两者杂交,表达特异基组织特异基表达组织均表达基产物形杂交 ,特异mRNA转录cDNA仍保持单链状态,种单链cDNA离即差异表达基,Chong等用技术克隆麦春化相关基 (Chong等,1994)
8 PCR扩增克隆
种参考已知基序列克隆基目前已经知道植物基序 列,克隆类似基先Gene bank库找关基序列,用PCR克隆同植物基基本根据已知基序列设计并合引物,植物提取DNA进行PCR扩增, 扩增片段纯化连接合适载体,用酶切析序列析检测重组,并与已知基序列进行比较,目前已玉米、水稻、向葵、巴西豆等植物离 富含甲硫氨酸蛋白及其编码基,根据Masumura等(1989)发表10KD水稻醇溶蛋白基序列合引物,王广立等克隆水稻10KD醇溶 蛋白基(王广立等,1994)
9 依据序列同源性克隆基
物种、属间编码基序列同源性高于非编码区序列 基本作其种属同源基克隆前提,构建cDNA文库或基组文库,已知基序列探针筛选目克隆马德钦等根据文献报道 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基序列作菠菜甜菜碱醛脱氢酶基克隆序列析(马德钦等,1996)
综所述,见发现克隆基 程艰巨富收获,几十各科家基克隆激物高技术领域内走艰难曲折历程,创造发展述种种植物基 克隆,使类认识自、掌握自道路前进步前辈所创造技术疑我功克隆植物基提供快捷高效途径利用已知 序列克隆基,用同种或同属已知同源序列筛选基都比较容易,适合于克隆些研究较晚许重要农作物基获极纯蛋白质功能克隆关键,随 着蛋白质纯化技术提高,功能克隆发挥潜作用随着植物遗传图谱基定位基础研究工作提高,定位克隆发挥其巨作用
基克隆利用体外重组技术,特定基其DNA顺序插入载体基克隆主要目标识别、离特异基并获基完整 全序列,确定染色体定位,阐明基化功能,明确其特定性状遗传控制关系通几十努力由于植物发育,理化,遗传等科迅速发展,使 掌握量关植物优良性状基物遗传知识,再运用先进酶物技术已经克隆与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育关许基我实验室麻抗真菌蛋白基作功能克隆研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),克隆植物基探讨 其克隆,本文论述基克隆策略、及取些进展
1 功能克隆(functional Cloning)
功能克 隆根据性状基本化特性功能信息,鉴定已知基功能克隆(Collis,1995)其具体作:纯化相应编码蛋白构建 cDNA文库或基组文库,DNA文库基筛选根据情况主要用二种办进行,(1)纯化蛋白质进行氨基酸测序,据合寡核苷酸探针cDNA 库或基组文库筛选编码基,(2)相应编码蛋白制相应抗体探针,cDNA入载体表达库筛选相应克隆功能克隆种经典基克隆策略, 基离利用种策略
Hain等葡萄克隆两编码白藜芦醇合二苯乙烯合酶基(Vst1Vst2),葡萄抗菌化合 物白藜芦醇存,提高灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)抗性,烟草其些植物二苯乙烯合酶,克隆该基经转基,些植物产灰质葡萄孢抗性意义(Hain 等,1985)Kondo等1989编码水稻巯基蛋白酶抑制剂基组DNA做克隆序列析(Kondo等,1989)周兆斓等构建水稻 cDNA文库,离编码水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA(周兆斓等,1996)植物蛋白酶抑制剂类抗虫物质,抑制摄食害虫蛋白质消 化,使害虫缺乏所需氨基酸导致非发育或死亡胡华等烟草离流行于我黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆编码该病毒外壳蛋白cDNA基(胡华等,1989)王春香等病烟草叶片离纯化马铃薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆完整马铃薯x病毒外壳蛋白基,并外壳蛋白基转入马铃薯,期获抗pvx病毒栽培种马铃薯(王春香等,1991)病毒外壳 蛋白(Coat protein cp)基功克隆,使转基植物产病毒外壳蛋白基介导抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导抗性Van kan 报道真菌功克隆毒基Avr9,直接利用基介导广谱高效基工程植物(Van Kan等,1991)我1995构建麻cDNA文库,制备抗体探针功离编码麻抗真菌蛋白基cDNA克隆,抗真菌基农业、医 药等面应用打基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)功能克隆特点用基表达产物蛋白质克隆基、虽某性状编码基未 知其理化及代谢途径研究比较清楚,离纯化控制该性状蛋白质功能克隆关键离纯度高蛋白质要纯 蛋白质,十特异探针,策略行效采用功能克隆虽已经克隆基,由于绝数基产物目前知道所数基 难用经典克隆随着物技术发展,条新基克隆策略逐渐形,定位克隆
2 定位克隆(Positional cloning)
根据遗传连锁析,染色体步移基定位染色体具体位置断缩筛选区域进克隆该基,研究该基功能或抗性化机制,种策略 叫定位克隆(Monaco,1994)连锁析即通基与DNA标记间重组系数估计两者间距离,若某种性状基与DNA标记代 离,即连锁起趋势根据原理与已知某DNA标记连锁基染色体定位由于连锁析需要依赖特定基作连锁标记,即标记基 与待研基间存连锁关系,满足与待研基相连锁基实太少,所连锁析克隆数基存着定困难RFLP现使态性基标记存 于整基组内,解决连锁析难克服困难
1980Wyman等科家首建立限制酶切片段度态性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使任何种表型相关基定位能限制酶切片段度态性用限制性内切酶切割产DNA片段度态性呈 孟德尔式遗传,存于全基组独特态标记,RFLP使基定位变易行(Wyman等,1980)目前定位克隆般用RFLP等标记制作 遗传图谱,寻找与待测基连锁RFLP标记,获基染色体定位克隆基所RFLP发展起RAPD技术建立,待测基相 准确定位,利用已知基离与连锁未知基其基本程序构建基组文库、用已知A基探针,基组文库筛选与其同源序列 a克隆,再用a克隆探针基组文库筛选与a克隆同源序列b克隆,类推筛选未知基并离目前已番茄、烟草、麦、 水稻、豆、玉米等植物发现与抗病基紧密连锁RFLP标记并构建遗传图谱(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)用种已别克隆拟南芥菜、番茄、水稻等植物关抗病基(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) Martin等1993早用定位克隆技术克隆番茄pto基,pto基负责带毒基Avrpto细菌,丁香假单胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株抗性,Pto基导入病番茄转基植株增强病原菌抗性(Martin等,1993)Wenyuan等1995用技术克隆 水稻Xa21基,Xa21基真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具抗性(Wenyuan等,1995)
3 转座标记(transposon tagging)
转座 基位置转移另位置DNA片段转座程原位置DNA片段(转座)并未消失,发转移转座拷贝、基发转座引起插入突 变使插入位置基失并诱导产突变型或插入位置现新编码基通转座标记基(抗药性等)检测突变基位置克隆突变基 转座标记转座作基定位标记通转座染色体插入嵌合克隆基(Fedoroff等,1984;Jones等, 1994)
利用转座克隆植物基操作步骤主要应几面:(1) 已离转座与选择标记构建含转座质粒载体(2) 转座导入目标植物(3) 利用Southern杂交等技术检测转座否载体质粒转座目标植物基组,转座定位离目标基所缺少(4) 转座插入突变鉴定及其离(Ellis等,1992)通用于克隆植物基转座玉米Ac. Mu, SmpDs等Ac含编码转座酶基,能够自主转座,Ds含转座酶所能自主转座,Ds-Ac系统AcDs提供转座酶自主 转座用转座标记进行植物基离,首要Ac等转座转化要进行基克隆植物,目前数利用土壤农杆菌介导转化系统转座导入 目标植物(Keller等,1993;Bancroft等,1993)目前已玉米、烟草、番茄、亚麻等植物克隆抗性基(Johal Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)JohalBrigge离抗灰色 蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号种玉米HMI特异真菌抗性基该基存于玉米抗性品种,能够解蠕孢1号种产玉米具特异致病性HC毒素, 该基编码HC毒素脱毒酶使植物具抗病性(JohalBriggs,1992)转座标记原理相似T-DNA标记,两者都由于 段基插入导致染色体结构发变化产突变体,T-DNA标记产突变由于T-DNA插入导致Kenneth等利用T-DNA插入标记培育 拟南芥矮化突变体(Kenneth等,1989)
4 工合并克隆基
蜘蛛毒素种肽,37氨基酸,体外实 验表明能杀死种农作物害昆虫,蒋红等1995根据蜘蛛毒素氨基酸序列,采用植物偏密码、工合并克隆肽基(蒋红等, 1995)Adang 1995工合苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基(Adang等,1995)
5 表型克隆(phenotype cloning)
1995JonssonWeissman提表型克隆概念(JonssonWeissman,1995),些植物目前即解基产物,没 进行基定位,已知植物表型存差异,利用表型差异或组织器官特异表达产差异克隆植物基表型克隆San等用表型差异拟南芥 克隆赤霉素合酶基(Sun等,1992)表型克隆策略试图表型与基结构或基表达特征联系起,离特定表型相关基,力求必 事先知道基化功能或图谱定位根据基表达效应直接离该基(Brown,1994)
6 mRNA差异显示(mRNA differential display)
1993LiangAverboukh 等科家提mRNA差异显示(mRNA DD, mRNA differential display)案(Liang等,1993)案依据高等真核物所命程病理变化,论由单基控制由基控制 ,终都通基表达质或量差异体现研究基表达差异,研究两基组差异表达基离,克隆复杂性状相关基辟重要途径该 案检测、离全任何部突变mRNA,其基本程序:(1)提取两种细胞mRNA,反转录2种cDNA(2) 定引物作随机聚合酶链反应(3) 通扩增产物电泳析,离同品间差异条带(4)差异DNA做探针(5) cDNA文库或基组文库筛选基并作功能析(Baeur等,1993)LiangPardee建立mRNA差别显示PCR (LiangPardee,1992),该同析几品间基表达,检测灵敏度高,PCR扩增,些表达量低mRNA能检测 ,应用PCR及DNA测序两种技术简单易行,目前已功用离麦热激蛋白基(Joshi等,1996)水稻蔗糖调节基(Tseng等, 1995)等
7 减杂交(Subtractive hybridization)
Lee等1991提减杂交技术 (Lee等,1991),植物发育程同组织或同组织同发育阶段,由于基特异性表达,其mRNA表现同,表达特异基组织 提取 mRNA,反转录cDNA,特异基表达组织提取mRNA,两者杂交,表达特异基组织特异基表达组织均表达基产物形杂交 ,特异mRNA转录cDNA仍保持单链状态,种单链cDNA离即差异表达基,Chong等用技术克隆麦春化相关基 (Chong等,1994)
8 PCR扩增克隆
种参考已知基序列克隆基目前已经知道植物基序 列,克隆类似基先Gene bank库找关基序列,用PCR克隆同植物基基本根据已知基序列设计并合引物,植物提取DNA进行PCR扩增, 扩增片段纯化连接合适载体,用酶切析序列析检测重组,并与已知基序列进行比较,目前已玉米、水稻、向葵、巴西豆等植物离 富含甲硫氨酸蛋白及其编码基,根据Masumura等(1989)发表10KD水稻醇溶蛋白基序列合引物,王广立等克隆水稻10KD醇溶 蛋白基(王广立等,1994)
9 依据序列同源性克隆基
物种、属间编码基序列同源性高于非编码区序列 基本作其种属同源基克隆前提,构建cDNA文库或基组文库,已知基序列探针筛选目克隆马德钦等根据文献报道 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基序列作菠菜甜菜碱醛脱氢酶基克隆序列析(马德钦等,1996)
综所述,见发现克隆基 程艰巨富收获,几十各科家基克隆激物高技术领域内走艰难曲折历程,创造发展述种种植物基 克隆,使类认识自、掌握自道路前进步前辈所创造技术疑我功克隆植物基提供快捷高效途径利用已知 序列克隆基,用同种或同属已知同源序列筛选基都比较容易,适合于克隆些研究较晚许重要农作物基获极纯蛋白质功能克隆关键,随 着蛋白质纯化技术提高,功能克隆发挥潜作用随着植物遗传图谱基定位基础研究工作提高,定位克隆发挥其巨作用
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