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| 实验方法原理 | 血清脂蛋白经苏丹黑B染色后，以琼脂糖为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带。按电泳移动的速度不同，正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β-脂蛋白（最深）、前β-脂蛋白（最浅）、α-脂蛋白（比前β-脂蛋白略深些）。在原点处应无乳糜微粒，也见不到中间脂蛋白的条带，有时前β-脂蛋白也显示不出来。 前β-脂蛋白比α-脂蛋白深染，且血清甘油三酯明显升高，胆固醇正常或略高，可以确定为Ⅳ型高血脂症。 β-脂蛋白区带比正常明显深染，血清总胆固醇明显增高而甘油三酯正常者为Ⅱa型高血脂症，血清总胆固醇增高而甘油三酯略高和前β深染者则为Ⅱb型高血脂症。 β和前β-脂蛋白两条区带连在一起彼此难以区分称为“宽β区带”，同时血清甘油三酯和胆固醇均有增高，可定为Ⅲ型高血脂症。 原点出现乳糜微粒，β和前β均正常或降低，同时血清甘油三酯明显增高，可定为Ⅰ型高血脂症。 | ||||||||
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| 实验材料 | 血清 试剂、试剂盒 | 苏丹黑B染色液巴比妥缓冲液Tris缓冲液 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶水平电泳设备载玻片离心机水浴锅 实验步骤 | 一、试剂 1.血清。 2.苏丹黑B染色液苏丹黑B的饱和无水乙醇溶液，用前过滤。 3.巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）为电极缓冲液。巴比妥钠25.4g，巴比妥2.76g，EDTA酸0.292g，加水溶解后用水稀释至1000mL。 4.Tris缓冲液（pH8.6）为凝胶缓冲液。Tris1.212g，EDTA酸0.292gNaCL5.85g，加水溶解后再加水至1000mL。 5.琼脂糖凝胶琼脂糖0.45g，Tris缓冲液50mL，加水50mL，边搅拌边加热至沸腾，待琼脂糖溶解后立即停止加热。 6.水平电泳设备。 7.37℃水浴。 8.离心机。 9.载玻片 10.切口刀刀口长15mm的刀片两片，中央夹一有机玻璃或木片，用螺丝固定，使两片刀片相距1.5mm。用相应的打槽器更好。 11.挖槽小匙用直径1.5mm的铜丝约6cm长，一端锤成扁平，用细砂纸磨光（用剪好的X光片亦可）。 血色素管或微量加样器。 二、操作步骤 1.预染血清血清0.2mL加苏丹黑B染色液0.02mL于小试管中，混合后置37℃水浴染色30分钟。然后2000r/min离心5分钟。 2.制备琼脂糖凝胶板将已经配置的0.45%琼脂糖凝胶置于沸水浴中加热融化。用吸管吸取凝胶溶液浇注载玻片，每片约2.5mL，静置约半小时后凝固（天热时需延长，或放冰箱数分钟加速凝固）。 3.点加血清在已经凝固的琼脂糖凝胶板距离一端约2cm处，用切口刀片（打槽器）垂直切入凝胶后立即取出，然后用铜丝小匙将长方小条凝胶取出。以小片滤纸吸干小槽内水分，用血色素吸管吸取经过预染的血清约15μl，注入凝胶板上的小槽内。 4.电泳将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于阴极一端。两块三层纱布于巴比妥缓冲液中浸湿，然后轻轻紧贴在凝胶板两端，纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中（注意：此电极缓冲液不能用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替）。接通电源，电压为120~130V，每片电流为3~4mA。约经45至55分钟，即可见到分离的色带。 注意事项 | 1.电泳样品应为新鲜的空腹血清。 2.加热溶化琼脂时，须防止水分蒸发过多。琼脂凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离结果。 3.在α-脂蛋白前若出现较浅区带，可列为α-前脂蛋白。 4.如果要保存电泳图形，可将凝胶板（连同玻片），置于清水中浸泡2小时脱盐，而后放入干燥箱（80℃左右）烘干即可。 5.制作凝胶板是琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜，高于1%以上α-脂蛋白部分较紧密，β-和前β-脂蛋白部分不够清晰，低于0.45%则凝胶凝固性较差，图谱不清。 6.样品槽要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图形。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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