番茄叶和根二维差异凝胶电泳(DIGE) 实验方法
| 试剂、试剂盒 | 叶片悬浮缓冲液EDTA水溶液硫脲缓冲液硫酸铵溶液SDS溶液 仪器、耗材 | 细胞等电聚焦电泳仪等电聚焦托盘及盖 实验步骤 | 3.1叶和根组织的收集和沉淀蛋白 (1)从植物的中部切取绿色叶片，迅速放入塑料袋里冷却。如果没有冰箱，可先放到冰上，再放入-20°C保存。 (2)对于根部组织，从茎部下面切一寸的根，摇晃根部并迅速放入水中洗掉泥土，连续洗3次，然后再迅速放入塑料袋里速冻或放在冰上暂时保存。 (3)称取2.5g速冻的根及叶组织，除去多余的茎及其他杂质，用预冷的剪刀将这些组织剪成小碎片，放入预冷的研钵中，在液氮中磨碎。 (4)将这些研碎的根叶组织放入40ml离心管中，用25ml悬浮缓冲液悬浮这些粉末，用力摇晃混合，放-20°C保存45min，再摇，35000g离心15min。 (5)除去上清液，不搅动沉淀，用相同体积的EDTA水溶液洗沉淀（见注释1)，放冰上3~4min。35000g离心15min，至少再洗两次，直到沉淀不再是绿色。 (6)沉淀冷冻干燥，直到变成灰褐色。它含有蛋白以及细胞壁和纤维等其他物质。 3.2从TCA/丙酮粉末中制备蛋白样本 (1)称取15mg的TCA/丙酮粉末（15.3.1中制备好的沉淀），放入1.5ml的离心管。 (2)向每一个离心管中加1ml的100mmol/LTris-HCl (pH8.5)，祸旋1min，18000g离心10min，去掉上清液（见注释2)。 (3)向每个离心管中加1ml的硫脲缓冲液，从粉末中萃取蛋白质，涡旋5min，超声10min。然后在摇床中摇30min。 (4)18000g离心10min，取上清液。上清液中含有从叶组织中抽取的蛋白质，浓度为0.5~1μg/μl。 3.3制备CyDyes染料及蛋白荧光标记 (1)用新鲜的DMF制备CyDyes (见注释3)，因DMF容易氧化降解，所以制备CyDyes染料时要用新鲜的DMF。 (2)制备CyDyes溶液，每1μlCyDyes染料中加入1.5μlDMF。1mlCyDyes溶液用来标记50μg的蛋白质（见注释4)。由于CyDyes对光敏感，故需用锡箔纸包住离心管，放在黑暗中保存。 (3)每个样品吸100μl(含有50μg的蛋白质）放入0.6ml的离心管中（见注释5)，这时候样品还是分开的，一个样品中放入1μlCy3工作液，另外一个样品中放入1μlCy5工作液（见注释6)。 (4)涡旋10s，短暂离心，重复两次。 (5)在冰上放置30min，避免光照。 (6)每个样品中加入1μl10mmol/L赖氨酸来终止反应，然后在冰上放置10min。 (7)每100μl荧光标记的样品加入250μlIPG缓冲液，终体积为450μl(见注释7)。 3.4第一向蛋白质分离：等电聚焦 (1)将Bio-Rad聚焦托盘放入Bio-Rad的聚焦室内。吸取样品放入中间的托盘内，避免气泡产生。 (2)用镊子去掉IPG干胶条的塑料皮，放入托盘里，确保阳极连着托盘的阳极，阴极对着阴极，仔细抬高胶条的一端，放下胶条的另外一端，确保整个胶条都能被缓冲液浸泡，还要确保没有气泡产生。 (3)用矿物油覆盖胶条，防止通电时胶条变干。 (4)通常完全聚焦需要最少67000Vh。 a.推荐程序：水化50V12h，500V1h，1000V1h，8000V9h，100V5h。 b.第一步为水化，不能少于12h，由于Cy染料对光敏感，所以聚焦托盘应该覆盖避免光照，或者整个仪器放在黑暗房间中使用。 c.最后一步是移除窗口，胶条在这期间能够取出。低电压确保胶条能够完全聚焦，直到从托盘中取出。 3.5SDS-PAGE二向凝胶的准备 (1)低荧光玻璃板减少背景的干扰。 a.为了扫描时易于操作，玻璃板凝胶接触的一面要涂抹亲和硅烷。为了凝胶好剥离下来，凝胶接触的另一面要涂抹剥离硅烷。 b.用Milli-Q超纯水和纸巾擦拭低荧光玻璃板不接触胶的那面，用乙醇和纸巾再擦拭一遍。 c.每次加0.5ml亲和硅烷工作液到不接触胶的那面，用纸巾使之均匀分散，直到每块板总的工作液有1ml。 (2)先用乙醇擦拭玻璃板，接着用水擦，逐渐加入0.5ml剥离硅烷直到每块玻璃板都抹上了1ml的剥离硅烷，干燥5~10min，除去多余液体。 (3)将玻璃板放在干净的地方干燥至少3h，注意亲和硅烷和剥离硅烷处理的玻璃板要分开放置。在灌胶前用氮气吹走玻璃板上的灰尘。 (4)将纸质圆点标记放于用亲和硅烷处理过的那面。每一个标记应当放在离板边缘约1.5cm的短边的中点。根据编号系统，标记也应当放置在板边缘约1.5cm处的底部。这样可以在随后的每一个处理步骤中区分不同的凝胶。 (5)12.5%凝胶的制备（总共900ml，可以灌12块胶）：281ml40%丙烯酰胺储液，225ml1.5mol/LTris-HClpH8.8，376mlMilli-QH2O，9ml10%SDS，9ml10%过硫酸铵，125μlTEMED。先将丙烯酰胺、Tris-HCl、Milli-QH2O和SDS放入大烧杯中彻底混合，再过滤这种混合物（0.2μmol/L)，然后放入一个贮存器中，贮存器通过一个蠕动泵和灌胶室连接。 (6)打幵搅拌器，迅速加入过硫酸铵和TEMED (15s内），打开蠕动泵。 a.当几乎所有的混合液被泵入时，打开混合器侧面让尽可能多的混合液泵入。 b.在空气进入管道前，加入置换液到软管室。 c.继续缓慢灌胶，直到12.5%的溶液刚好低于不接触胶板的顶部。 (7)关上泵，加入水饱和的丁醇以确保覆盖住胶的顶部和下部（丁醇在分隔液的上部），放置1h，然后倒掉丁醇，覆盖Milli-QH2O。 (8)胶最好是在室温放置过夜，当彻底凝固时再用。拆除灌胶仪器，洗掉玻璃板上的丙烯酰胺。立刻用胶或者放冰箱暂存（最多可以保存一个星期）。 3.6二向蛋白质分离：SDS-PAGE (1)从托盘中取出等电聚焦胶条，用Kimwipe轻轻擦拭胶条的前后端以除去过多的矿物油，小心不要将Kimwipe触到胶条，如果需要干胶条可以保存在-80°C冰箱中。 (2)将胶条放在平衡托盘中，一端稍高放置。 a.在摇床上，用2ml新鲜的还原再平衡缓冲液洗胶条30min。 b.弃还原再平衡缓冲液，加2ml新鲜的烷基化再平衡缓冲液。 c.摇床摇30min，弃烷基化平衡缓冲液。 d.加2mLSDS电泳缓冲液，摇床摇5min。 (3)仔细将胶条放入预先制备好的24cm的凝胶上（见15.3.5节），将胶条的塑料一端靠在玻璃板的一端，这样使胶条容易、方便放置在凝胶上，胶条和凝胶之间不能有气泡，用0.5%(m/V)的琼脂糖密封液密封胶条，吸取密封液，放置在胶条上部，室温凝固。 (4)将凝胶的胶板放入与循环的冷水系统相连的Ettan DALTsix电泳室里。 a.将胶放在小槽的外部，当同时跑几块胶时，将它们均匀地放在两边，面向同一个方向。 b.将空胶板放在池子里，直到每个槽都放满。 c.灌入电泳缓冲液，直到到达最大刻度线的底部。 d.将盖子与底部电源接通，开始电泳。 e.如果是过夜电泳，设置电量为2W/gel。如果只在白天电泳，可以提高电压，但不要超过8W/gel。 3.7荧光图像扫描 (1)打开Typhoon扫描仪，在使用前先预热30min，预热是为了扫描更精确。 (2)在使用前后都必须用乙醇和擦拭纸将玻璃板擦干净。不要用纸巾擦拭，因为容易刮伤玻璃面。 (3)将玻璃板从胶槽中取出，表面擦干净，将玻璃cassettes中的荧光标记凝胶按正确的方向放在玻璃板上。 (4)用合适的滤波和波长来扫描图像，每种标记物的波长如下：Cy3用580BP的滤波，532nm的绿色激发光；Cy5用670BP的滤波，633nm的红色激发光；Cy2用520BP的滤波，488nm的蓝色激发光。初始参数为depth+3mm，600V光电倍增管设置和500μm的像素，反复进行50~100μm的像素高分辨率扫描。 (5)用Typhoon扫描仪软件可以获得图像，用数据集格式保存在包含gel图像的相关文件夹中，这样可以用ImageQuant打开，然后可以用数据集格式再保存，用来在DeCyder作进一步的处理。或者Tiff格式，可以使用其他图像分析包来做进一步的处理，如Progenesis (Nonlinear Dynamics)。 3.8图像分析 通过不同波长所获得的图片用DeCyder进行比较分析（见注释8)，由于程序复杂，在此不作详细介绍，基本步骤如下所述。 (1)为了确保图像大小完全匹配，用ProcessImage测量而且进行标准化，产生一个柱状图，显示两张图片中没有产生变化的、增加的、减少的蛋白质点数量。 (2)使用排除过滤法，或手动删除任何明显的非蛋白质背景斑点或条纹。按照需要，调整柱状图的临界参数显示蛋白质点。这些蛋白质点是指定量的上调或下调表达，如大于2倍的差异。 (3)手动检查柱状图和图像，以确定哪些点有明显表达变化，而且有足够的量用于质谱鉴定。在大多数情况下，许多蛋白质尽管有显著差异表达，但由于量很少以致于无法进行可靠的定量和可行的鉴定。最值得研究的蛋白质点通常具有中、高丰度而且差异表达非常明显。 (4)为了更精确地定量差异表达，特别是差异性非常微弱的情况下，整个程序需要重复3次，这样结果才有统计学意义（见注释8)。 3.9为了进一步处理进行再染 接下来是进行图像分析。取走玻璃盒里的隔条，胶进行银染[29，30]。银染要在固定的玻璃板上进行，这样可方便观察，并且可以手工挖取蛋白质点，以进行下一步的质谱鉴定[6]。相对于CyDye标记只能标记少部分蛋白质而言[8]，银染能保证绝大多数的蛋白质都能标记上。通过银染，用CyDye标记的大部分蛋白都能看见，尽管在不同的样品之间还是有一些变化。比对银染的图像和CyDye图像，小心确保挖到正确的点。一些小分子质量的CyDye通常会引起一些漂移，一些蛋白用不同方法也会引起一些差异（见注释9)。 3.10结果分析：番茄根部响应盐胁迫的蛋白质表达差异测定 1.盐胁迫处理 (1)在控温温室里，让番茄长到4英寸（1英寸=25.4mm)高。 (2)在试种时，将20棵幼苗在包含MiracleGro肥料的Hoglan混合肥料中生长。 (3)所有20棵植株每天正常浇水。20天后，对其中的10株进行标记，用25mmol/LNaCl处理一个星期。在此后的一个月时间里，逐渐将NaCl浓度提高到100mmol/L。 (4)10株对照植物在整个期间都用水浇灌。 2.叶和根组织的收集 (1)在7个星期期间，在连续浇灌了两个星期的100mmol/L氯化钠之后，剪下3~5g对照及处理的健康植株叶片，一个星期两次，直到叶片坏死。 (2)—旦叶片坏死，植株连根拔起，用水冲洗根部，从根的中部分成近茎端和远茎端两部分，立刻液氮中进行速冻。 3.近茎端蛋白质的抽提 (1)用研锤将收集到近茎端根研碎。 (2)按15.3.1节提到的TCA丙酮方法制备蛋白质沉淀物。 (3)由于凝胶上显示根所含的蛋白质比叶少，有必要按15.3.2节的方法抽提3次蛋白质，将这3次抽提的蛋白质放入到一个离心管中，进行CyDye标记。 (4)汇集样品，跑胶用15.3.3节、15.3.6节的方法分析，结果见图15-1~图15-4。    4.对照及盐胁迫的近根组织部分DIGE凝胶的图像比较分析 来源于4.3的数据用DIA模型进行分析，这种模型在15.3.8节中已有介绍。从DeCyder程序输出的起始数据用虚拟颜色代表，如图15-1所示。Cy5标记的对照植株蛋白点为红色，Cy3标记的盐胁迫植株的蛋白质点为绿色，两种植株都有且表达量相似的蛋白点为黄色。这样对于那些表达差异明显的蛋白质易于识别。在这个实验示例中，绝大多数的蛋白质点为黄色，说明这两个样品中蛋白表达差异不是很明显。 两种荧光波长扫描的不同图像如图15-2所示，这些图像可以用来进一步分析蛋白质表达差异。这两张图像看起来很相似，但是图15-2B上的蛋白点更多。总体蛋白质载入或者是标记效率有明显的区别，这也是这种方法的一个显著优点。软件可用于标准化这两张图像的表达量，所有的蛋白点包含在内，只有那些表达量高于或低于平均值的蛋白质点被标示为差异蛋白点。 两个图像的定量分析产生的柱状图如图15-3所示。正如蛋白质点检测窗口所示，在标准化和处理后，软件检测到421个蛋白质点，其中有384个没有变化的蛋白点，34个Cy3标记的表达量升高的蛋白点，3个Cy5标记的表达量升髙的蛋白点。x轴为这两个图片的蛋白质点的体积的log值的比率，左边的y轴为蛋白质点的频率，右边的y轴为代表每个蛋白点的绝对突光强度，也就是蛋白质量。蓝色曲线表示蛋白质点频率模式柱状图，是基于红色曲线的实际柱状图生成的。 两条垂直的线表示蛋白质表达差异达1.5倍的x轴点和表达没有变化的蛋白质点，颜色使用策略和图15-1相似，黄色代表没有变化的蛋白点，绿色代表Cy3标记表达量升高的蛋白点，红色代表Cy5标记表达量升高的蛋白点。 在这种类型的分析中，许多蛋白点检测到表达量上有变化，但是这种变化是很微弱的以至于不易鉴定。在图15-3的分析中，我们运用了一个绝对荧光阈值即106荧光单元（如虚线所示）来排除这些蛋白质点。这里有4个蛋白质点，标记为a~d，x轴上在正常分布曲线之外，y轴上超出了106荧光单元，因此这些蛋白点为Cy3标记的表达量超过1.5倍的蛋白点，这种表达量可以用来进行质谱鉴定。在柱状图里还有很多蛋白质表达差异显著，但是低于我们指定的阈值。 这4个强调的蛋白质代表那些响应盐胁迫并且上调表达量超过1.5倍的蛋白质。前3个蛋白点即标记为a、b和c的蛋白点突显了这种方法的缺点，它们是一个低分辨率蛋白质的一部分，这个蛋白质已经用分析软件人工划分为几个蛋白点。然而标记为d的蛋白点是一个髙分辨率的蛋白点，荧光体积率为1.79，如图15-4所示，这个蛋白点可以切下来进行质谱鉴定。 |
|---|
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2018-08-06
阅读（189）
▍
相关分类
▍
相关文章
生命科学学院三槽PCR仪设备采购项目中标公告
电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验
fine是什么意思?帮你突破I’m fine的框框 蔡妈笔记网
巯基蛋白酶抑制剂学术百科知网空间
葛均波院士等建议:高值医用耗材集中带量应给厂家生存机会 新浪...
5.2.2乙二醛/DMSO变性琼脂糖凝胶电泳
美国BIORADTransBlotSD半干转印系统转印槽1703940_上海凌仪生物_新浪...
life technologies代理 life technologies
使用siRNA、miRNA mimic 、premiRNA进行miRNA 生物学功能...
固相化pH梯度双向凝胶电泳实验13资讯
医院手术室标书(电解板)
激光捕获显微切割仪Laser capture microdissection(LCM)得用一用
▍
相关问答
