禽流感病毒H7亚型(AIVH7)核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法) 科研...
| 实验材料 | 组织提取物 试剂、试剂盒 | GUS缓冲液MUG 仪器、耗材 | 96孔板数显荧光计 实验步骤 | 1.分别取25μl和50μl组织提取物样品于96孔板中（黑色或者白色），包括未转化的对照组织，加GUS缓冲液至总体积为200μl，混匀。 2.加入100μl含2.5mg/mlMUG（终浓度为2mmol/L)的GUS缓冲液以开始反应，混匀，加盖。 3.37℃温浴，反应5~10 min。取50μl反应液加入另一个含有200μl0.2mol/LNa2CO3的微型板中，以终止反应。然后按照合适的时间间隔（10min、20min、30min或1h)，再取50μl，进行相同的操作。 4.在365nm的激发光、455nm的发射光下，用数显荧光计测量MU产物的荧光量。检测样品产生的线性动力学关系，蛋白提取物稀释值及重复测量的荧光量是否相对应。 5.GUS活性可以用pmolMU/min/mg蛋白来表示。其中MU标准物按照荧光读数器线性关系的浓度（如0~5μmol/L)，通过0.2mol/L的Na2CO3溶液稀释，并置于板上。1mmol/L的MU甘油溶液应4℃保存，使用前检测有无Na2CO3的沉淀。 或者，荧光活性也可以用荧光单位（flu) /ng蛋白/min表示。要把这个值转化为UidA蛋白的量，需要用纯化的GUS酶（E.coliVII-A，Sigma)绘制标准曲线：用GUS缓冲液稀释GUS酶至0.1ng/μl的工作浓度，在总体积为50μl的GUS缓冲液中加入0~2ng的GUS酶，按照上面的步骤进行分析。 6.有些植物组织含有高水平的内源性GUS活性，但可以优化反应条件来检测这些组织的GUS活性。 |
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发布于 ： 2021-08-04
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