代谢综合征患者单核细胞_高密度脂蛋白比值与靶器官损害的相关性分析...
| 实验材料 | PRSETB细菌表达质粒HeLa细胞株 试剂、试剂盒 | 苯甲基横酰基氟化物EGTA缓冲液氯化钙缓冲液 仪器、耗材 | 超声发生器荧光光谱仪 实验步骤 | 本文中描述的方法涵盖了变色子在细菌及真核细胞里的克隆与表达（见4.3.1)，变色子的生物化学和生物物理特征鉴定（见4.3.2)，以及通过FRET技术将变色子用于体内Ca2+成像（见4.3.3)。 3.1变色子的克隆 使用5个不同的部件：CFP、YFP、N-CaM、C-CaM和CRS，用标准的重组DNA方法[8]模块式组装钙变色子。CFP和YFP质粒可从Clontech购得；CaM来自Dr.Ikum；CRS用寡核苷酸链反应合成。为制取钙变色子的DNA操控不在这里详细讲述，因为没有适合所有可能性的单一技术（见注4)。钙变色子制成之后，融合片段克隆到PRSETB质粒中，以表达足够蛋白，完成生物化学和生物物理鉴定。我们把融合片段克隆到pCDNA3质粒中（见注5)，以供体内Ca2+成像实验用的瞬时哺乳细胞表达。 3.2生物化学和生物物理鉴定 钙变色子在能够用于体内Ca2+成像之前，先提纯（见4.3.2.1和注6)并完成体内荧光实验，以确定其动态范围（见4.3.2.2)和钙离子结合曲线（见4.3.2.3)。 3.2.1钙变色子从细菌细胞中提纯 (1)用标准的分子生物学方法以细菌质粒转染BL21(DE3)细胞[8]。 (2)把细胞平铺在含氨苄青霉素的LB平板上，37°C保温过夜。 (3)选择一单菌落，37°C，在100ml含100μmol/L氨苄青霉素的LB培养液中生长。 (4)在600nm光学密度为0.7时，用0.5mmol/LIPTG诱导3h。 (5)以3000g离心细胞30min。 (6)重悬细胞于10ml，pH7.4，含10%甘油、100mmol氯化钾、1mmol/L氯化钙和1mmol/L苯基甲基磺酰基氟化物的50mmol/LHEPES中。 (7)用0.5英寸超声头以最大功率，10%工作周期，超声4次，每次4min。两次超声之间，溶液降温5min。 (8)以30000g离心细胞碎片20min。 (9)在4°C轻轻地混合上清液与1mlNi-NTA琼脂糖浆液30min。 (10)以10ml含100mmol/L氯化钾和5mmol/L咪唑pH7.4的50mmol/LHEPES洗柱。 (11)用1ml含100mmol/L氯化钾和100mmol/L咪唑的50mmol/LHEPES洗脱。不需要切掉His-tag，因为它并不干扰荧光特性。 (12)在4°C，用2L含100mmol/L氯化钾，pH7.4的50mmol/LHEPES透析样品。 3.2.2荧光谱分析 FRET效率的变化（或者，在钙变色子的情形下，Ca2+浓度的变化）常常可以从发射比的变化观察到（只为受体发射的峰值强度除以给体的峰值发射强度）。Ca2+指示子的动态范围定义为最大比率Rmax除以最小比率Rmin。较大的动态范围在体内Ca2+指示上更有效。 (1)在装有含100mmol/L氯化钾，20μmol/LEGTA的50mmol/LHEPES的1ml试管中稀释样品。只要发射信号保持可测，任何稀释因子都可用。在433nm激发下，记录从450~570nm的荧光发射谱。 (2)记录空白样品的荧光发射谱。 (3)从第（1)步的记录中减去第（2)步的记录，以得到在无Ca2+条件下钙变色子的荧光谱。从这个谱中确定Rmin。 (4)在1mmol/LCa2+存在的条件下，重复（1)~（3)步，以确定Ca2+存在时钙变色子的荧光谱。 (5)图4.3显示YC6.1[5]在加入Ca2+之前和之后的荧光谱，及Rmax和Rmin分别为1.1和2.4。  3.2.3Ca2+结合性质 Ca2+结合曲线用来评估Ca2+指示器能够测量的[Ca2+]的有效范围。Ca2+/EDTA和Ca2+/EGTA缓冲液用来作为浓度标准，因为在低[Ca2+]，Ca2+污染会显著地扭曲空白[Ca2+]水平（见注7)。 (1)在1ml试管中，用EGTA稀释样品。在433nm激发下，记录从450~570nm的荧光发射谱。确定激发比。 (2)为得到Ca2+结合曲线，连续地加入氯化钙溶液到样品中，并测定发射比。因为本章描述的实验是在20°C的EGTA和氯化钙缓冲液中完成的，通过解下述二次方程(如在不同条件下，请参考文献[9])可求得自由钙：  (3)为绘出Ca2+结合曲线，将[Ca2+]对发射比作图。图4.4显示YC6.1的Ca2+结合曲线。  3.3用钙变色子使Ca2+成像 本节描述简单的HeLa细胞中Ca2+成像实验；但是只需很小的修正，此方法可应用于其他的黏着细胞和生理条件。分别描述细胞培养液制备（见4.3.3.1)和数据采集(见4.3.3.2)。 3.3.1细胞培养液制备 (1)把HeLa细胞铺在装有DMEM-10%FBS培养液的直径为35mm的玻璃皿上。 (2)在37°C(5%二氧化碳）保育，直到50%~80%细胞汇合。 (3)使用Genejuice(Novagen)，将含钙变色子的哺乳细胞表达质粒转染细胞。 (4)6h以后移除转染混合液，代之以1.5ml的DMEM-10%FBS培养液。 (5)在37°C(5%二氧化碳）保育24h。能完成Ca2+成像实验的细胞已备好。 4.3.3.2数据采集 实验应该在暗室中完成，以减少背景光。图4.5显示我们使用的显微设备。  (1)打开氙灯、显微镜、滤光转换器和计算机。 (2)从培养皿中移除培养基。 (3)用1mlHBSS(+氯化钙）清洗。 (4)加入1ml新鲜的HBSS(+氯化钙）。 (5)把细胞放在显微镜台面上。 (6)启动MetaFluor软件。在采集数据时，MetaFluor软件控制快门、滤光转换器和照相机。 (7)用目镜挑选YFP荧光，以发现表达钙变色子的细胞。把滤光指示转到U-WNIBA带通直角镜位置，并根据荧光发射水平，使ND滤镜在0.1%~10%。U-WNIBA直角镜对使用目镜快速发现YFP荧光细胞很实用，而10%ND滤镜是用来防止光褪色。 (8)使用40X油物镜，把显微视场中心移到外观健康、并呈现强胞质体荧光的细胞上。图4.6是显示健康HeLa细胞典型荧光分布的画面。 (9)用MetaFluor在计算机荧屏上逐幅采集图像，同时调节聚焦直至得到最清晰的图像。 (10)把滤光指示转到CFP-YFP FRET直角镜位置。 (11)为监控作为CFP对时间的峰值激发的结果的CFP和YFP的峰值激发，课置如下数据采集条件：时间间隔大于10s；对CFP和YFP，曝光时间200ms。MetaFluor会显示发射比随时间的变化。 (12)在CCD图像上选择一块感兴趣的区域。通常这个区域要涵盖感兴趣的细胞。然后开始数据采集。在感兴趣的区域内的CFP和YFP的荧光发射强度，和它们的发射比一起，会得到实时监控（见注8)。 (13)当发射比达到稳衡态，向培养皿中加入50μl12mmol/L组胺，使终浓度大约为100μmol/L。操作过程要小心，不要移动培养皿。组胺结合到质膜上的受体上，启动信号级联，使Ca2+从内质网通过肌糖-1，4，5-三磷酸受体释放[10，11]。这将会引起钙变色子的构象变化，因YFP发射强度增加CFP强度减弱而被观察到。因而，发射比应该增加。当组胺作用消退后，发射比应该减退到稳衡态水平。图4.6显示MetaFluor软件在采集数据时的一幅荧屏照片。  (14)为使发射比与胞质体[Ca2+]相关联，必须测定Rmin和Rmax，以便把发射比映射到Ca2+结合曲线上。加入50μl的20μmol/L离子霉素，使终浓度近似为1μmol/L。离子霉素在质膜上把通道打开，以让Ca2+渗过。由于培养基的氯化钙饱和，发射比会升高到Rmax。为测定Rmin，加入50μl100mmol/L的EGTA和600μmol/LBAPTA-AM，使终浓度分别近似为5mmol/L和30μmol/L。发射比应该会降到Rmin。 (15)停止数据采集。 |
|---|
免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
版权声明 未经蚂蚁淘授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
发布于 ： 2018-08-07
阅读（141）
▍
相关分类
▍
相关文章
Organizations
彗星实验（Comet assay）如何做？
美人工合成抗艾新药外源凝集素_爱学术
M13噬菌体单链DNA的制备
临床化学分析技术的新进展
小鼠己糖激酶(HK)ELISA检测试剂盒(大鼠,人)_小鼠ELISA试剂盒上海...
考马斯亮蓝R250及G250染料
荧光剂的危害到底有多大?真相在这里_增白剂
一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及制备方法
Directory: Top/World/Chinese_Simplified/健康/药学/组织
Ernesto Alejandro Lozano Sabido Guadalajara Area, Mexico |...
一、荧光标记单参数检测造血干细胞——CD34FITC_CNKI学问
▍
相关问答
