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美国Thermo Scientific™ Applied Biosystems 7500实时荧光 ...

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实验步骤	基本方案1单细胞表面抗原的免疫荧光标记材料基本方案2固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记材料辅助方案1用异硫氰酸荧光黄（FITC)偶联抗体材料 6.计算荧光素/蛋白质比（F/P): F/P=FITC摩尔数/蛋白质摩尔数；F/P=5:1〜6:1最适于流式细胞仪使用。辅助方案2长臂生物素偶联抗体遵循FITC偶联方法（见辅助方案1)，替换以下试剂和步骤见特别说明。附加材料（其他材料见辅助方案1，带V项目见附录1) V琥珀酰亚胺乙酯标记缓冲液 10mg/ml长臂生物素（long-armedBiotin，Zymed公司）溶于DMSO，临用前配制 1.用与FITC偶联相同的方法透析1〜2mg/ml的纯化抗体。在透析时，用琥珀酰亚胺乙酯标记缓冲液代替FITC标记缓冲液。在A28。处检测吸光度，确定抗体浓度 (=A₂₈₀X0.74X稀释倍数）。 2.每毫克抗体加入IOmI的lOmg/ml用无水DMSO配制的长臂生物素。室温孵育lh。用与FITC相同的方法去除未结合的生物素（见辅助方案1)。备选方案1未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测附加材料备选方案2用7-氨基放线菌素D(7-AAD)标记死细胞附加材料

实验步骤

基本方案1单细胞表面抗原的免疫荧光标记

材料

基本方案2固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记

材料

辅助方案1用异硫氰酸荧光黄（FITC)偶联抗体

材料

6.计算荧光素/蛋白质比（F/P):
F/P=FITC摩尔数/蛋白质摩尔数；F/P=5:1〜6:1最适于流式细胞仪使用。

辅助方案2长臂生物素偶联抗体

遵循FITC偶联方法（见辅助方案1)，替换以下试剂和步骤见特别说明。
附加材料（其他材料见辅助方案1，带V项目见附录1)

V琥珀酰亚胺乙酯标记缓冲液
10mg/ml长臂生物素（long-armedBiotin，Zymed公司）溶于DMSO，临用前配制
1.用与FITC偶联相同的方法透析1〜2mg/ml的纯化抗体。在透析时，用琥珀酰亚胺
乙酯标记缓冲液代替FITC标记缓冲液。在A28。处检测吸光度，确定抗体浓度
(=A₂₈₀X0.74X稀释倍数）。
2.每毫克抗体加入IOmI的lOmg/ml用无水DMSO配制的长臂生物素。室温孵育lh。
用与FITC相同的方法去除未结合的生物素（见辅助方案1)。