葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP),Glucosedependent ...
| 实验材料 | 植物组织 试剂、试剂盒 | 苯酚提取缓冲液沉淀液等电聚焦缓冲液 仪器、耗材 | 低温粉碎机 实验步骤 | 3.1蛋白质提取 (1)新鲜植物组织在液氮中冷冻，然后在自动低温粉碎机中预先冷却的钢杯中将材料研磨成细碎的粉末（见注释4)。 (2)在一个15ml的离心管（falcon tube)中加入3ml提取缓冲液，并加入1g研碎的植物组织，涡旋后在冰浴中振荡10min(见注释5)。 (3)加入等体积的Tris饱和苯酚，室温下振荡10min(见注释6)。 (4)样品在5500g和4°C的条件下离心10min，从上到下分成有机相，水相和沉淀的不溶物质（见注释7)，小心地将最上层的苯酚转移到新的离心管中，注意避免触碰到中间层。 (5)含蛋白质的苯酚液中加入3ml的提取缓冲液进行反萃取（back-extract) 。振荡3min后涡旋。然后样品在5500g和4°C条件下离心10min。 (6)转移上层酚相到新离心管中，并加入4倍体积的沉淀液。颠倒振荡离心管，在-20°C条件下沉淀至少4h，或者过夜。 (7)离心沉淀蛋白质（10min、5500g、4°C)。 (8)离心后，用预冷沉淀液漂洗沉淀3次，最后用预冷丙酮漂洗。在每一次漂洗后，样品都要离心（5min，5500g、4°C)。 (9)真空干燥沉淀（见注释8)。 蛋白质首先被提取到含有几种保护剂的Tris缓冲液中。EDTA通过螯合金属离子来抑制金属蛋白酶（metalloprotease)和多酚氧化酶（polyphenol oxidases)。PMSF能够不可逆地抑制丝氨酸蛋白酶（serine protease)。β-巯基乙醇是一种防止蛋白质被氧化的还原剂。此外，为抑制蛋白酶活性，实验温度必须保持在4°C以下，第一步提取要在冰浴中进行。尽量缩短提取时间。使用KCl是因为它的盐溶性效果好，这可以提高蛋白质溶解度而有利于蛋白质提取。 相对于传统的苯酚提取法，Wang等提出另一种可行方法，由于加入了十二烷基磺酸钠（SDS)，因此称为苯酚/SDS提取法。这种方法明显增大了从橄榄叶组织中的蛋白质提取量，双向电泳比较清晰，并且比起单用苯酚得到更多更浓的蛋白点。但是，加入SDS不能使从香蕉、苹果和马铃薯叶片中提取蛋白质的效果提高。 含蔗糖的Tris缓冲液比Tris饱和苯酚密度大。所以在相分离时，可以使苯酚相更快地分离到离心管的最上部，有利于转移苯酚相（见注释7)。在上部的苯酚相中含有胞质蛋白和膜蛋白。 pH8.0的Tris饱和酚溶液能保证核酸分离至缓冲液相中，而不使核酸留在苯酚相中。 蛋白质通常用加入盐或者水溶性有机溶剂的方法进行分离。在这里，两种方法都被应用。4倍体积的甲醇可以有效地分离出大部分蛋白质。但是，甲醇从酸性溶液中提取蛋白质的效果较差。使用有机碱或缓冲液（乙酸铵）可以解决这个问题。 3.2蛋白质的溶解和定量 (1)蛋白质沉淀重悬于IEF缓冲液。如果起始材料是1g新鲜的番茄果实组织，需要200μlIEF缓冲液。 (2)样液需要在室温条件下振荡至少1h(有时需要更长时间）。不要加热样品，否则会导致蛋白质的氨基甲酰化（carbamylation)。 (3)定量时，需要一些用IEF缓冲液稀释卵清蛋白（ovalbumin)标准液（8份稀释液，分别从0μg/μl到60μg/μl）。然后，在每份稀释液中分别加入10μl0.1mol/LHCl。最后，无论用于制作标准曲线还是用于样品浓度测定的样品管，都用蒸馏水定容至100μl。 (4)然后加入3.5ml稀释的染色剂，并在595nm读出样液的吸光值。 测定植物组织中的蛋白质浓度，考马斯亮蓝法[9]比Lowry法[10]及Biuret法更合适，因为后两者都是基于定量酚类化合物[1]。但是，由于IEF缓冲液成分的干扰，不易在样品缓冲液中直接定量。因此，我们采取改良的Ramagli和Rodriguez，它基于样品缓冲液的酸化处理，即使缓冲液里含有尿素、载体两性电解质（carrier ampholytes)、非离子去垢剂和硫醇类化合物，仍可用于直接定量溶于样品缓冲液里的蛋白质。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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