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【专题讨论】蛋白分离纯化及填料选择问题超强技术支持,尽管问:)[精华]
2021-07-22
问题描述:

chromatography战友,
我打算用HPLC分离已经初步纯化的蛋白,大小40kd到200kd,机器是安捷伦1200.
目前只有C18的柱子,用来分环肽。
如果分比较大的蛋白,有什么效果相对好的柱子,请推荐一下。

在网上见到有人说C18也可以试着分析大蛋白,不知道会不会堵,洗不下来?

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chromatography
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展开引用1234567_zhh 新手请教前辈:1。超声破碎会把大肠杆菌诱导表达的目的蛋白质片段打碎从而影响其活性吗?我在大肠杆菌中诱导的是蛋白磷酸酶,一种融合蛋白,要保持其活性,请问用哪一种常规破碎方法比较好?2。Ni-NTA过柱需要那些填料?麻烦高手您给说细致些,谢谢。3。本人在做一种蛋白磷酸酶,所买试剂盒的缓冲液呈碱性,是8.4,与我酶的等电点(7.2)不符合, ,问要在这种情况下操作使该酶不失活,并且得率可以,该如何操作或者是改变什么条件?谢谢了.4。过普通大小的镍或钴凝胶层析柱,需要摇多少菌就可以?5。镍柱和钴柱都可以进行组氨酸标签蛋白质的纯化,在纯化一个组氨酸标签的融合蛋白(酶)两者可以互换吗,前者换为后者是否影响活性?如果不能,有什么条件限制?......1.控制好温度,超声破碎应该没问题.2.需要镍NTA琼脂糖凝胶或别的Ni-NTA填料及柱子或直接买预装柱,详细使用见www.wsac.cn 资料下载下的镍NTA琼脂糖凝胶FF说明书.3.最好查资料,如果不清楚可先用试试.4.最好别选钴的,作用力太弱.要多少不清楚,因为和你表达量有关,一毫升填料可上5-10mg目标蛋白,所以可自己计算.5,没问题.
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chromatography
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展开引用海上的1900chromatography战友,我打算用HPLC分离已经初步纯化的蛋白,大小40kd到200kd,机器是安捷伦1200.目前只有C18的柱子,用来分环肽。如果分比较大的蛋白,有什么效果相对好的柱子,请推荐一下。在网上见到有人说C18也可以试着分析大蛋白,不知道会不会堵,洗不下来?......应该可以,只要你填料孔径是300埃的适合蛋白分析的就可以,最好问公司技术人员.
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xingtingting
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chromatography兄您好:今天做了个实验出现个现象我不太明白,麻烦你帮我分析一下:一个蛋白用ni-柱亲和层析纯化,平衡缓冲液位20mMpb,ph8.0,0.5mNACL,1mMDTT,可是刚开始平衡时ni柱就变成棕色的了,怀疑是DTT的原因,以前做过此实验,没有加DTT,没有出现过类似现象,DTT对ni柱有什么影响啊?
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chromatography
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展开引用xingtingtingchromatography兄您好:今天做了个实验出现个现象我不太明白,麻烦你帮我分析一下:一个蛋白用ni-柱亲和层析纯化,平衡缓冲液位20mMpb,ph8.0,0.5mNACL,1mMDTT,可是刚开始平衡时ni柱就变成棕色的了,怀疑是DTT的原因,以前做过此实验,没有加DTT,没有出现过类似现象,DTT对ni柱有什么影响啊?......对,被还原了,可改用ni-NTA填料或别加DTT.
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zxdlilon
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chromatography老师:您好,我有几个问题想请教您,就是我看到GE公司resourceS和Q预装柱的说明书,有“阴离子柱应避免使用阴离子型去垢剂,阳离子柱应避免使用阳离子型去垢剂”,不知道如果使用了会对柱子有什么损害?还有就是我现在在纯化一种蛋白,但是要用到一种“兼性去垢剂”,不知道能不能带着它上resourceS和Q柱呢?谢谢!
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chromatography
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展开引用zxdlilonchromatography老师:您好,我有几个问题想请教您,就是我看到GE公司resourceS和Q预装柱的说明书,有“阴离子柱应避免使用阴离子型去垢剂,阳离子柱应避免使用阳离子型去垢剂”,不知道如果使用了会对柱子有什么损害?还有就是我现在在纯化一种蛋白,但是要用到一种“兼性去垢剂”,不知道能不能带着它上resourceS和Q柱呢?谢谢!......我觉得你可试试,通常去垢剂对离子柱子没什么损害,要不你可问他们的工程师.
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xingtingting
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chromatography兄您好:我想问您一下羟基磷灰石这种介质应该如何溶胀啊?
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chromatography
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xingtingtingchromatography兄您好:我想问您一下羟基磷灰石这种介质应该如何溶胀啊?这填料有好几钟,不同厂家不一样,你最好是看说明书,干粉的通常直接泡过夜,如果是液体保存的就不需要溶胀,装柱用即可.
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wujinzi
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请问楼主,我要用COIP的方法纯化细胞系中的蛋白质,所用抗体的量和浓度是多少?多谢!
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chromatography
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wujinzi请问楼主,我要用COIP的方法纯化细胞系中的蛋白质,所用抗体的量和浓度是多少?多谢!你最好是查文献或实验书,我没做过.
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yunlei0920
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chromatography兄您好:我是一个新手,我用的是pQE80L作为表达载体诱导的一个蛋白,这个蛋白诱导之后用超声碎菌上清可见到一个23KD的特异条带,把这个诱导的蛋白纯化之后跑电泳发现蛋白条带的位置升高了,变成了27KD,做Western结果也显示在27KD有结合的条带,我想问您估计是什么原因出现的这种现象?这种现象怎么考虑?
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chromatography
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展开引用yunlei0920chromatography兄您好:我是一个新手,我用的是pQE80L作为表达载体诱导的一个蛋白,这个蛋白诱导之后用超声碎菌上清可见到一个23KD的特异条带,把这个诱导的蛋白纯化之后跑电泳发现蛋白条带的位置升高了,变成了27KD,做Western结果也显示在27KD有结合的条带,我想问您估计是什么原因出现的这种现象?这种现象怎么考虑?......我觉得也许是什么东西干扰电泳,你把上清和纯化后样品换同样缓冲体系,再跑电泳我想也许就一致了.
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xiaoweichun
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你好,我的蛋白不挂柱,怎么办哪?我用的是HIS-TAG纯化,用PET28a载体表达,WB有信号,用Binding-buffer:500MmMnacl,10mMNa2HPO4,10mMNaH2PO4,20mM咪唑ph>9Elutionbuffer:4Mnacl,80mMNa2HPO4,80mMNaH2PO4,500mM咪唑ph>9用尿素变性情况下也作了一次电泳检测还是没有挂住,在穿过液里留有目的蛋白,洗脱液里没有。我的蛋白PI约在12左右,是不是ph不合适啊,
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chromatography
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展开引用xiaoweichun你好,我的蛋白不挂柱,怎么办哪?我用的是HIS-TAG纯化,用PET28a载体表达,WB有信号,用Binding-buffer:500MmMnacl,10mMNa2HPO4,10mMNaH2PO4,20mM咪唑ph>9Elutionbuffer:4Mnacl,80mMNa2HPO4,80mMNaH2PO4,500mM咪唑ph>9用尿素变性情况下也作了一次电泳检测还是没有挂住,在穿过液里留有目的蛋白,洗脱液里没有。我的蛋白PI约在12左右,是不是ph不合适啊,......也许你填料作用力弱,或蛋白本身和镍离子的作用力弱,表达量不高要多上样品,说太多次这个了,你可自己去www.wsac.cn资料下载下参考<常见重组蛋白提取纯化>及镍柱的说明书.
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潘思拉佳
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你好,我想提取鹿茸多肽,文献上说17000以下部分比较有用,是用醇提的,但是回收醇这一步需要加热怕破坏其有效成分。考虑先用超滤装置粗分,在用凝胶层析细分,但是超滤是水做溶剂的,不知有效地多肽能不能够提取出来,请指教!昨天发了一遍,由于积分不够看不到你的回答,请再写一遍,多谢!
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chromatography
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展开引用潘思拉佳你好,我想提取鹿茸多肽,文献上说17000以下部分比较有用,是用醇提的,但是回收醇这一步需要加热怕破坏其有效成分。考虑先用超滤装置粗分,在用凝胶层析细分,但是超滤是水做溶剂的,不知有效地多肽能不能够提取出来,请指教!昨天发了一遍,由于积分不够看不到你的回答,请再写一遍,多谢!......回收乙醇可选择旋转蒸发的方法,温度也不高,至于后者我不清楚,需要做了才知道.你最好先按文献做.
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trainwriter
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请问楼主,我的蛋白N端接了GST-tag,C端接了His-tag,想要进行两步纯化来得到全长的纯度高的蛋白。请问应该先过镍柱比较好呢?还是先用GlutathioneSepharose4B进行批量纯化呢?我现在已经尝试将蛋白过了镍柱,得到的蛋白洗脱液(500mMimidazole,500mMNaCl,20mMTris-HCl,pH6.0)可以直接和GlutathioneSepharose4B孵育过夜来结合吗?这种beads和蛋白的结合会受哪些因素影响呢?
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展开引用trainwriter请问楼主,我的蛋白N端接了GST-tag,C端接了His-tag,想要进行两步纯化来得到全长的纯度高的蛋白。请问应该先过镍柱比较好呢?还是先用GlutathioneSepharose4B进行批量纯化呢?我现在已经尝试将蛋白过了镍柱,得到的蛋白洗脱液(500mMimidazole,500mMNaCl,20mMTris-HCl,pH6.0)可以直接和GlutathioneSepharose4B孵育过夜来结合吗?这种beads和蛋白的结合会受哪些因素影响呢?......要是我选择,我觉得最好先过GST亲和柱子,这样容易得到只有两条带的样品,然后透析或稀释再过镍拄,这样空的GST就不被吸附,直接用咪唑可洗脱目标蛋白,如果反过来一是要摸条件,二是收率低,三是时间长怕GST部分没活性导致难挂亲和柱。结合的影响可看说明书及相关纯化材料。主要是受GST本身活性影响大。
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dai鸢尾
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chromatography老兄,向您请假一个问题,我想分离一分泌型蛋白,干预时所用培养基为optiMEM,取细胞上清液用丙酮沉淀全部蛋白后,这些蛋白不能重新溶解,就算是用尿素也不能全溶,请问您知道什么原因吗?那些不溶的是什么成分呢?要怎么改进我的操作?还有我做的WESTERN背景都很黑,是什么原因呢?谢谢
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chromatography
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展开引用dai鸢尾chromatography老兄,向您请假一个问题,我想分离一分泌型蛋白,干预时所用培养基为optiMEM,取细胞上清液用丙酮沉淀全部蛋白后,这些蛋白不能重新溶解,就算是用尿素也不能全溶,请问您知道什么原因吗?那些不溶的是什么成分呢?要怎么改进我的操作?还有我做的WESTERN背景都很黑,是什么原因呢?谢谢......我也不清楚不溶解的,你可取不溶解的加电泳上样缓冲液跑电泳看看,我觉得也会有非蛋白的东西,你可用盐酸胍溶解试试,至于WESTERN我更不熟悉,你发外面问问.
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disy
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楼主师兄:请问过完NTA柱后,咪唑洗脱的,再过DEAE离子交换柱,咪唑会对离子交换有影响吗,如果有该怎么解决?(这个蛋白要先过NTA再过DEAE)谢谢!
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chromatography
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disy楼主师兄:请问过完NTA柱后,咪唑洗脱的,再过DEAE离子交换柱,咪唑会对离子交换有影响吗,如果有该怎么解决?(这个蛋白要先过NTA再过DEAE)谢谢!你可试试,我没这样做过.实验自己做做不就知道了.如果影响那就透析或用除盐柱去掉咪唑
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潘思拉佳
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你好,还是鹿茸多肽提取的问题,老板说最好在4度的条件下做,怕把有效地成分破坏了,所以乙醇提取肯定是不行了。现在想问按您的经验,这种20000一下的多肽,分子量几千和一万多,是水溶性的吗?用水提的得率会高吗?有的文献用缓冲盐提取是不是好一点?请赐教!
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xmf427
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你好,请教一下,我的目的蛋白是30kd的,用G50葡聚糖的柱子过柱后蛋白还是跟其他的很多蛋白在一起,浓缩,过了滤过膜后蛋白就只剩下了百分之10,,换了透析管还是跟其他的蛋白很难分离,请问有什么好的建议?急呀!谢谢
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ivan0828
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chromatography我也不清楚不溶解的,你可取不溶解的加电泳上样缓冲液跑电泳看看,我觉得也会有非蛋白的东西,你可用盐酸胍溶解试试,至于WESTERN我更不熟悉,你发外面问问.你改用2%的SDS溶解试试,如果仍然不溶再用甲醇试试,疏水性太强的有可能盐酸胍的溶解量也有限,WB片子黑是不是你暗室漏光,另外就是你的加样量过大,显色时整个片子都可见到光亮也会造成片子发黑,或者是发光液过于敏感。
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ivan0828
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chromatography你可试试,我没这样做过.实验自己做做不就知道了.如果影响那就透析或用除盐柱去掉咪唑咪唑有影响,你要把样品做个更换缓冲也处理,用G25脱盐柱就可以,换成你要上柱的缓冲液进行下一步试验。
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chromatography
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帖子已被删除2.6x20cm的柱子即可.
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chromatography
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潘思拉佳你好,还是鹿茸多肽提取的问题,老板说最好在4度的条件下做,怕把有效地成分破坏了,所以乙醇提取肯定是不行了。现在想问按您的经验,这种20000一下的多肽,分子量几千和一万多,是水溶性的吗?用水提的得率会高吗?有的文献用缓冲盐提取是不是好一点?请赐教!那你就先按文献做.
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chromatography
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xmf427你好,请教一下,我的目的蛋白是30kd的,用G50葡聚糖的柱子过柱后蛋白还是跟其他的很多蛋白在一起,浓缩,过了滤过膜后蛋白就只剩下了百分之10,,换了透析管还是跟其他的蛋白很难分离,请问有什么好的建议?急呀!谢谢如果凝胶柱子不行,可选择离子交换等别的方法,过滤,透析没太可能有很好的分离效果,多看书
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qingdaoqqb
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楼主你好!我在分离一种分子量在26kD左右,pI在4.5左右的蛋白质,由于色素较多,先上了SephadexG-75柱子除掉了大部分的色素,再上DEAESepharoseFF时遇到了麻烦,试了pH7.5和8.5的Tris-HCl缓冲液,但是蛋白质都挂不到柱子上,就是挂不住啊,请楼主给支个招啊,谢谢!
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风云必胜
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chromatograph兄:硫酸铵沉淀的蛋白样品使用50mMPB1MNaCl溶解后,我想给它换液,以便于离子交换,除了使用G-25外,我想问可以使用sephrose4FF么?我要分离的蛋白的分子量是100-220Kd
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chromatography
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qingdaoqqb楼主你好!我在分离一种分子量在26kD左右,pI在4.5左右的蛋白质,由于色素较多,先上了SephadexG-75柱子除掉了大部分的色素,再上DEAESepharoseFF时遇到了麻烦,试了pH7.5和8.5的Tris-HCl缓冲液,但是蛋白质都挂不到柱子上,就是挂不住啊,请楼主给支个招啊,谢谢!你降低缓冲液浓度到10mM试试,此外样品中不能有盐,如果还挂不上,那杂蛋白能挂上也算分离,你可用SP的柱子试试.
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