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제품특징
□ 특징
● Illumina NGS sequencer와 Ion Torrent sequencer에 적용가능한 NGS Library 제작
● Single cell 또는 10pg 수준의 극소량 total RNA 샘플에서 cDNA 합성 가능
● 간단하고 빠른 1 tube protocol
● GC 함량이 높은 유전자도 효율적으로 증폭가능한 SeqAmp DNA Polymerase 포함
● 기존 SMARTer Ultra Low 시리즈보다 검출 유전자 수가 대폭 향상됨
□ 제품설명
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing은 Single Cell, 극소량 (Ultra-Low input) 샘플을 위한 SMARTer Ultra Lowkit 시리즈의 4세대 제품으로써 매우 적은 양의total RNA로부터 NGS용 cDNA library를제작할 수 있다. 본 제품은 Clontech의 핵심기술인 SMART (Switching Mechanism at 5’ End of RNA Template)에 Locked Nucleic Acid (LNA) 기술을 접목함으로써 이전 세대의 제품보다 더욱 많은 수의 유전자수를검출할 수 있다. 본 제품의 핵심기술인 SMART (Switching Mechanism at 5’ Endof RNA Template) 법은 세포의 splice junction과 alternative splicing event를 포함한 전반적인 전사체 연구(full transcriptome analysis)에 있어 매우 유용한 기술이다. 또한, 본 제품은 high quality RNA (RIN > 8)나 intact cell로부터 특이적으로 mRNA를 증폭할 수 있다. 이와 함께 LNA 기술은template switching의 효율을 더욱 향상시켰으므로 그 어떤 제품보다 유전자 검출 수를 증폭시킬 수 있다.
□ Applications
- Transcriptome sequencing을 위한 극소량의 totalRNA 또는 single cell에서 cDNA 합성 - 본 제품으로 합성한 cDNA는Clontech LowInput Library Prep Kit (code 634947) 또는 Nextera XTlibrary preparation kits을 사용하여 Illumina 용 NGS Library제작 가능 - 또한, Ion Xpress Plus FragmentLibrary Kit을 사용하여 Ion Torrent용NGS Library 제작 가능
Figure1. Flowchart of SMART cDNA synthesis. The SMART-Seqv4 Oligonucleotide, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A, and PCR Primer II A allcontain a stretch of identical sequence. The black star indicates a chemicalblock on the 5’ end of the oligonucleotide.
Figure 2. Higher sensitivity and better mappabilitywith the SMART-Seq v4 kit.Replicate libraries were generated from10 pg Mouse Brain Total RNA using the SMART-Seq v4 kit, the SMARTer Ultra Low v3 kit, or the SMART-Seq2 method. 18 PCR cycles were used to amplify cDNAlibraries with the SMART-Seq2 method and SMARTer Ultra Low v3 kit; however,only 17 PCR cycles were needed for the SMART-Seq v4 libraries. 
Figure3. Gene body coverage is good for all three library preparation methods. Gene body coverage shown is the average of two replicate librariesprepared from 10 pg Mouse Brain Total RNA using the three different cDNAsynthesis methods. The SMARTer Ultra Low v3 kit produced a slight 3′ bias, andthe SMART-Seq v4 kit produced a slight 5′ bias; however, the overall coveragewas fairly even.
Figure4. Reproducibility is high for low-input samples. FPKMs from replicate libraries generated from10 pg of Mouse Brain Total RNAusing the SMART-Seq v4 kit, the SMARTer Ultra Low v3 kit method were compared.For transcripts with FPKM <100, the correlation between replicates was muchhigher for the SMART-Seq v4 kit (Pearson R = 0.739; Panel B) compared to theSMARTer Ultra Low v3 (Pearson R = 0.376; Panel A). For all transcripts (shownin the scatterplots on the right) the correlation between replicates was highfor each of the three methods (Pearson R between 0.911-0.972), though theSMART-Seq v4 kit did have the highest correlation. Transcripts represented inonly one replicate can be seen along the X- and Y-axes of the scatter plotsshowing all transcripts.
□ 구성품
* SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit forSequencing Components (not sold separately)* SeqAmp DNA Polymerase
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如要膜蛋白保持原来的结构应采用：非离子型去垢剂.
去垢剂作为添加剂生长蛋白质晶体是一项很有用的技术。非离子和两性离子结晶剂在膜蛋白结晶中已经得到很好应用,目前已经变成常规的实验手段。去垢剂在一些可溶蛋白中也起到了一定的作用,提高了晶体的质量和结果的可重复性 ,促进了单晶的生长, 但具体的影响机制尚不明确。其可能原因是去垢剂的引入使结晶液滴中的蛋白分子更具有亲水性,使溶液中同质蛋白质分子增加。向左转|向右转
表面活性剂：通常由一个极性头和一个非极性尾组成，用于去除难溶于水的污渍
漂白剂：通常含次氯酸盐成分，原理为其氧化性
稀盐酸：用于去除碱性的污渍，如马桶中的结块
碳酸钠溶液：用于去除油渍，其原理为酯在碱溶液中水解，参见皂化反应
我要做的两个目的蛋白，分子量一个是140的，另一个是36，内参用的GAPDH。这几天刚刚要做小鼠组织的蛋白，就把新提取的组织蛋白和之前做过的细胞蛋白一起上了，细胞和组织的各上了3个孔。
电泳转膜孵育等条件都是以前做成熟的
之后显影，细胞蛋白的，两个目的和内参都出得挺好；但是小鼠的组织蛋白只有分子量140的那个显出条带了，36的那个显出来的像一片水渍一样，斑片状的黑，内参有时也这样、有时干脆什么都不显。不知道这是什么原因...按说细胞同样的蛋白做出来，WB的各个步骤应该不会有太大问题的。
有点怀疑蛋白提取的不好，我提组织蛋白的的操作是在冰上进行的，裂解液也加有PMSF，用BCA法测得的蛋白浓度大概也有3~5mg/ml。
在这里求助各位高手~望给我指点一下~不胜感激啊！
我打算用HPLC分离已经初步纯化的蛋白，大小40kd到200kd，机器是安捷伦1200.
目前只有C18的柱子，用来分环肽。
如果分比较大的蛋白，有什么效果相对好的柱子，请推荐一下。
在网上见到有人说C18也可以试着分析大蛋白，不知道会不会堵，洗不下来？
