RNA的剪接机制
| 试剂、试剂盒 | 缓冲液和溶液细胞裂解缓冲液NaOHTris-缓冲盐溶液TBSTritonX-100溶菌酶胰DNA酶I制备用于文库筛选的抗体大肠杆菌培养液 仪器、耗材 | 离心和转子亲和层析柱溴化氢活化的Sepharose4B 实验步骤 | 材料 缓冲液和溶液 贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录12 将贮存液稀释到适当的浓度。 细胞裂解缓冲液 0.1mol/L醋酸钠 1mol/LNaCl 用0.45um滤膜过滤细胞裂解缓冲液，室温贮存。每1L培养细菌需要大约100ml细胞裂解缓冲液。 NaOH(1mol/L) Tris-缓冲盐溶液（TBS)和含0.2%(m/V)叠氮化钠的TBS TritonX-100 酶和缓冲液 溶菌酶 使用分子生物学级的溶菌酶。加入固体洧菌酶以辅助裂解细菌。 胰DNA酶I 在细胞裂解液中加入固体DNA酶I消化染色体DNA。 抗体 制备用于文库筛选的抗体 利用蛋白A-Sepharose亲和层析制备的IgG片段，本方案可获得最佳效果。用蛋白Aipharoae介质的亲和层析法，请见Harlow和Lane法（1999)。 培养基 培养液 需要1升合适的大肠杆菌培养液。 离心和转子 SorvalGSA转子或相当转子 SorvalSS-34转子或相当转子 专用设备 亲和层析柱 5ml塞有玻璃棉的塑料注射器或Bi-RadPoly-Prep柱子均适用。 溴化氢活化的Sepharose4B(AmershamPharmaciaBiotech)或Affi-GellO(BiaRad) 载体和菌株 大肠杆菌作为制备表达文库的宿主菌 方法 1.将适当菌株（如Y1090hsdR、XLl-Blue或DH1)的1L培养物培养至静止期。 2.用SorvallGSA转头（5000r/min)于4°C以4000g离心20min收获菌体。 3.弃去培养基，倒置离心管排出残留培养液。 4.将沉淀物重悬于100ml的细胞裂解缓冲液中。 5.加入200mg溶菌酶，于室温温育菌液20min。 6.加入1mg胰DNA酶,和200ulTritonX-100。 7.于4°C温育菌液1h,或温育至上清由混浊变清亮且黏度降低。 8.将细菌裂解液于4°C以8000g(8200r/min用SorvallSS-34转头）离心20min,小心将上清液倒入另一个烧杯内。 9.用1mol/LNaOH将上清液pH调至9.0。 10.用Lowry,Bradford或其他方法检测裂解液中蛋白的浓度。 11.将提取液骤冷至0°C,并按操作说明将菌体蛋白质结合于溴化氢活化的Sepharose4B或Affi-Gel10。 12.使用前，用含0.2%(m/V)叠氮化钠的TBS平衡与大肠杆菌提取物结合的Sepharose4B或Affi-Gel10树脂。 13.每通过亲和层析纯化1mgIgG,需要1ml固定体积的与大肠杆菌抗原相偶联的树脂。IgG和偶联的树脂混匀后，在转鼓中于室溫溫育12~18h。 14.将匀浆液装到亲和层析柱上。用TBS洗脱抗体。收集洗脱液（每管0.2柱床体积）至OD280降为0。合并各管抗体，并将亲和纯化抗体贮存于-20°C,以备免疫筛选时用。 |
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发布于 ： 2021-07-30
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