电生理
| 实验方法原理 | 首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作「桥梁」，将它们连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的定位。 其基本流程为：抗原+特异性抗体→第二抗体（桥抗）→抗HRP抗体→HRP→DAB+H2O2（显色）。 因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的，与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点，能与抗酶抗体结合，所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中，酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的，从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害，提高了方法的敏感性，降低了非特异性染色。染色原理见图4-7。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 石蜡切片动物血清冰冻切片细胞涂片 试剂、试剂盒 | 胰蛋白酶特异性一抗桥抗体PBSDABH2O2丙酮甲醇抗酶抗体HRP酶苏木精盐酸乙醇乙醇树胶 仪器、耗材 | 滴管玻片 实验步骤 | 1.石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定10min，PBS洗3min×3次。 2.滴加0.3%H2O2甲醇液，室温处理20min，PBS洗3min×3次（抑内源性过氧化物酶活性）。 3.0.1%胰蛋白酶37°C消化20min或AR（只限于石蜡片），PBS洗3min×3次。 4.滴加1:（5～20）正常羊血清或牛血清20min（室温或37℃），吸去多余血清，不洗。 5.适当稀释的特异性一抗（例如来自种属A）37℃孵育60min或4℃过夜，PBS洗3×3min。 6.第二抗体（也称桥抗体，抗种属A的IgG抗体）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。 7.抗酶抗体（来自种属A）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。 8.酶（HRP70～100μg/ml，PBS溶解）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。 9.0.04%DAB+0.03%H2O2显色8～12min，最好在光镜下控制。 10.充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化15～30s。 11.常规树胶封片，结果观察。 注意事项 | 其他 | |
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发布于 ： 2021-08-10
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