| 实验步骤 | 材料（带V项目见附录1)裸鼠，6〜8周龄，无特殊病原（SPF)，或者是同基因型宿主（注射小鼠-小鼠杂交瘤时） 姥鲛焼（Pristane，2,6，10，14-四甲基十五焼；Aldrich公司提供） 杂交瘤（单元1.3) 添加10mmol/LHEPES和lmmol/L丙酮酸钠的DMEM-10完全（附录1)培养基 PBS或HBSS，已消毒，不含FBS 10%(m/V)叠氮钠 18G和20G或22G注射针头 175cm2组织培养用细颈瓶 50ml和15ml塑料锥底离心管，无菌 IOml注射器，无菌 56°C水浴 0.45um过滤装置 1.于接种细胞前一周，用20G或22G针头给每一只小鼠腹腔内注射姥鲛烷0.5〜lml。始终保证小鼠处于SPF设施中。远交系裸鼠虽然更加昂贵，但无需放射线处理；不一定必须使用近交系裸鼠。 2.在盛有添加的10mmol/LHEPES和lmmol/L丙酮酸钠的DMEM-IO完全（附录1)培养基的175cm2培养瓶中增殖杂交瘤，保持细胞处于对数生长期。在接种小鼠（步骤5)之前，用ELISA(单元1.1)或其他检测方法检测培养上清中MAb的活性，检测最好在细胞扩增之前进行。为了降低病原体进入鼠类细胞克隆的风险，应该用抗体形成实验（CPI单元1.1)检测细胞中的病原体。 3.将培养物移入50ml锥底离心管中。室温下，500g离心5min，弃上清。用50ml已消毒的不含FBS的PBS或HBSS重悬、洗涤细胞，并再次离心，弃上清。重复2次后重悬细胞于5mlPBS或HBSS。 4.进行细胞计数，并用台盼蓝拒染试验（附录3C)检测细胞活力是否接近100%。加入不含FBS的PBS或HBSS调整细胞密度为2.5XIO6个细胞/ml。 5.用IOml注射器抽取细胞。使用22G针头向裸鼠腹腔内注射2ml细胞。注射3只小鼠，通常至少会有一只且往往全部的小鼠都能产生含有MAb的腹水。腹水的产生需1〜2周；若需要最大量的腹水应多等待3〜7d。 6.抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，绷紧腹部皮肤（附录20。另一只手将一个18G的针头刺入腹腔1〜2cm。针头刺入时应选择左下腹或右下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。在针头刺入之前应先确保针的尾部已对准15ml塑料锥底离心管，流出的腹水可以直接滴入离心管中。 7.若操作中出现问题，可以参考以下解决办法。 a.若小鼠有大量的腹水但是无法流出，可以将针头缓慢地旋转，或换一个位置插入。 b.若没有腹水积蓄且小鼠的健康状况尚好，可以重新注射细胞。 c.若没有腹水积蓄且小鼠死亡（尤其是在注射后2周内发生死亡），下次注射时减少细胞的量。 d.若形成了实体的肿瘤，将肿瘤细胞打散、重悬，并用以注射另一只姥鲛烷预处理的小鼠。 e.若只形成了少量的腹水，将其注射另一只预处理的小鼠（大约〇.5ml/只）。 8.室温下，1500g离心腹水IOmin。若液体在离心管内凝结，在离心前用细木棒在凝块与离心管壁间刮一圈，若凝块附在木棒上则将其丢弃，否则不做处理，离心后凝块将成为沉淀的部分。 9.取上清，弃沉淀。在所有腹水收集完之前将先离心得到的腹水保存于4°C(不超过一周）。 10.让小鼠重新积蓄腹水（2〜3d)，按照步骤6再次提取腹水，按照步骤8对腹水进行处理。多次重复提取腹水，直到不再有腹水生成或小鼠死亡。将剩余的小鼠处死(附录2G)。 11.将之前多次抽取的腹水混合，在56°C水浴中热灭活45min。若有凝块形成，用步骤8中的方法刮离、离心去除。 12.用适当的方法检测腹水的MAb滴度。以大于1:10的比例稀释，并用0.45um过滤装置过滤除菌。若不对腹水进行生物学检测，则加入10%的叠氮钠溶液至总量的0.02%。分装腹水，一70°C冻存，并避免反复冻融，可以储存数年。 |
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