WesternblotanalysisusingtheantibodydirectedagainstASH2
Figure1A:WesternblotwasperformedusingtheantibodyagainsthASH2(cat.#25209)diluted1:1,000inTBS-Tweencontaining5%skimmedmilkonnuclearextractsfromHeLacells(upperpanel:lane1)andectopicallyexpressedFLAG-taggedASH2(ASH2-F,upperpanel:lane2).Thelowerpanelshowsthesamewesternblotwithananti-FLAGantibody.ThemolecularweightMarkerisshownontheleft.
Figure1B:WesternblotwasperformedusingnuclearextractsfromHeLacells(HeLaNE,20μg)withtheantibodyagainstASH2(cat.#25209)diluted1:1,000inTBS-Tweencontaining5%skimmedmilk.Themolecularweightmarker(inkDa)isshownontheleft;thelocationoftheproteinofinterestisindicatedontheright.
Storeat–80°Cforupto2years.Centrifugeafterfirstthawtomaximizeproductrecovery.Aliquottoavoidrepeatedfreeze/thawcycles.Aliquotsmaybestoredat–20°Cforatleastonemonth.
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制备抗体都需要进行纯化处理
不过多克隆抗体因为有多个结合位点,事实上的特异性并不如单克隆抗体,所以一般Western blot都尽量要求使用单克隆抗体。以保证实验结果准确可靠
抗体的特异性鉴定 抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高,它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线,计算各自的结合率,求出各自在 IC50时的浓度,并按下列公式计算交叉反应率。 如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管,而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时,表示 这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为 0,即该血清的特异性较好。
抗体的亲和力 是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示,K的单位是L/mol,通常K的范围在 108 ~1010 /mol,也有多达 1014 /mol。抗体亲和力的测定对抗体的筛选,确定抗体的用途,验证抗体的均一性等均有重要意义。向左转|向右转