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Details
Description:Mouse monoclonal antibody to human Transforming Growth Factor beta (TGF-β)
Purification: Protein G affinity purified
Product Type:Primary antibody
Target Protein:Human TGF-β
Immunogen:TGF-βfrom human platelets
Fusion Myeloma: Sp2/0-Ag14
Specificity:Western blotting demonstrated that this antibody reacts with the dimeric (25 kDa) and monomeric (12.5 kDa.) forms of TGF-β under both non-reducing and reducing conditions respectively. This antibody recognizes both human platelet-derived and recombinant TGF-β in ELISA.
Species Reactivity: Human, others not tested.
Host / Isotype: Mouse, IgG1 Kappa
Formulation: Lyophilized in 0.01M PBS, pH 7.0.
Reconstitution:Double distilled water is recommended and to adjust the final concentration to 1.00 mg/mL.
Storage: Store at -20oC
Research Area:Growth Factors and Their Receptors, Angiogenesis
Background:
Transforming growth factor beta (TGF-β) has three isoforms (TGF-β1, TGF-β2, and TGF-β3) with similar functions.
The cytokine is a homodimer linked by disulfide bind. Inside cells, the cytokine forms a small latent complex with latent associated peptide (LAP). This small complex binds to latent TGF-β binding protein (LTBP) to be secreted to extra-cellular matrix. Disassociation of the latent proteins from TGF-β results in the release of the cytokine to its receptor. The process is called activation, which can be influenced by various factors, including proteases, metalloproteases, extreme pH, mild acidic condition, reactive oxygen species and integrins.
TGF-β is an anti-proliferation factor in normal cells. It increases the synthesis of p15 and p21, which can block the cyclin: CDK complex, and causes cells to stop at G1 phase. The cytokine can induce apoptosis through both SMAD and DAXX pathways. In cancer cells, TGF-β signaling is altered and TGF-β no longer stops cell proliferation.
Applications:
ELISA:The antibody reacts with TGF-β.
IHC: Can be used in immunohistochemcal applications.
Neutralizing:This antibody neutralizes TGF-β activity in vitro and in vivo.In an inhibition assay of CCL/64 cell growth and in a NRK-49F colony forming assay, the antibody neutralized TGF-β bioactivities. The effect of micro-injection of this antibody into one blastomere of two cell stage Xenopus embryos indicated that it was also able to neutralize the bioactivity of TGF-βin vivo.
References:
If research is published using this product, please inform Anogen in order to cite the reference on this datasheet. Anogen will provide one unit of product in the same category as gratitude.
Additional
Additional Information
| Product Specificity | mAb anti-Human TGF-β, 8C4 |
|---|---|
| Application | EIA, IHC, NT, WB |
| Size | 0.1 mg |
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A.优点：
多重分析——一次分析可以检测16种干细胞相关的TF
定量比较——二个样本的差异可以定量分析和比较
步骤简单——探针温育、柱分离、板杂交和HRP检测
无需贵重仪器——无需如Luminex那样的贵重仪器
B.原理：
干细胞转录因子活性多重检测阵列试剂用于同时检测多种TF活性。该技术中，基于TFDNA结合位点的一致性序列，制备一系列生物素标记的探针。当探针混合物与核提取物一起温育时，每个探针寻找相应的TF，形成TF/探针复合物，通过柱离心纯化可以很容易与游离探针分开。结合的探针从混合物中分离出来，通过板杂交分析。板孔中预包被上与探针互补的特异序列，捕获的DNA探针进一步用链酶亲和素-HRP检测，化学发光检测仪测定发光强度（RLUs）。
一、机械裂解法主要有以下两中：
1．热休克（Thermal shock）,既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,.原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2．超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：
50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系）,150 mM NaCl（等渗体系）,1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂）,1 mM EDTA（变性剂和稳定剂）,5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂）,5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂）,1% Triton x-100（破坏细胞）,1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂）,0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）.7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解）,蛋白酶K等.
我的邮箱：maoyuanqing@citiz.net
样品处理：
a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。
b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。
d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。
e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。
将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。
2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。
吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃ 12000rpm离心2min，弃废液。7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。9. 12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。10. 将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。
注意事项：
所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯，需电泳检测。
【2】加入裂解液后可以加用超声破碎细胞。
【3】提完细胞的器具可以在显微镜下看一下，剩余的细胞还多不多。如果还多，说明细胞提取的不彻底，还要改进方法，争取提取的细胞彻底一些。
（仅供参考）
裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。
这样可不可以？
另还有几个问题：1、这样的裂解液裂解线粒体提蛋白可不可以
2、裂解液加多少剂量
3、12000g离心10min和30分钟有没有区别
(1)1×107细胞重悬,其来源可为新鲜样品或贮存于-80℃1mol冰冻清洗缓冲液中
的无DMSO的样品,冰冻缓冲液包括10mMHEPES(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCl,
1mM二硫苏糖醇(DTT),然后离心(16000rpm、4℃、1min)。
(2)重悬细胞团于100ul冰冻裂解缓冲液,其包含10mMTris-HCl(pH7.5),1mMMgCl2,1mMEGTA,0.1mM苯甲基磺酰氟(DMSF),5mMB2巯基乙醇,0.5%CHAPs(Pierce)和10%甘油。
(3)冰育30分,然后在超速离心机中离心30分钟。
(4)去上清,液氮速冻沉淀,裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0.1ug荧光标记的cx反转引物,蜡封(5′CCCTTACCCTTACCC
TTACCCTTA3′)。
(2)于蜡界之上加50ulTRAP反应物,包括Tris-Cl(pH8.3)20mM,1.5mMMgCl2,
63mMKCl,0.005%,TWeen20,1mMEGTA,50mM三磷酸脱氧核苷,0.1ug荧光标记
TS前导引物(5′AATCCGTCGAGCAGAGTT3′),1ugT4基因32蛋白,牛血清白蛋白0.1mg/ml,2UTaqNDA聚合酶(Takara,shyzou)和5ugCHAPs细胞提取液。荧光标记TS引物可由市场购得。扩增前5ug提取物与1ugRNA酶37℃水浴20分钟,为了端粒酶活性的标准化,运用体内端粒酶活性标准(TTAS):TS重叠引物和CX重叠引物(TS:5′AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC3′及CX:5′CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTATAGGCGCTCAATGTA3′)TS(18bp)和CX(24bp)序列为普通型,下划线标出的为成肌素序列(每个15bp)。成肌素CDNA通过这些引物扩
增产生了150bp的产物,它可用与ITAS扩增端粒酶梯度相同的TS引物和CX引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram以显现I-TAS,它并不干扰TRAP测量。
(3)置于22℃10分钟,作为TS引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90秒。
(4)PCR扩增,条件94℃30S,50℃30S,72℃1.5min;共27循环。
三、分析
(1)制备8%的变性胶(longRanger,ATBiochem)含6M尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE)于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul混合后上样,上样缓冲液含90%甲酰胺和10%蓝葡聚
糖(Bluedertian)。
(4)95℃预发性4分钟,速冷,上样,运用100bp,150bp,200bp大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由FiagmuntManager程序自动分析,每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值,一部分PCR产物应在蒸馏水稀释后再分析
不知单纯使用冰浴中超声裂解够了吗？还是说要选用裂解液呢？最主要的就是我不知道该怎么赔这个裂解液，使其COX活性不产生影响
