| Formulation | 50%glycerol/water(v/v) |
| Storage | -20°C |
| Purity | >95%bySDS-PAGE |
| ActivityDetermination | Fibrinogenclottingorchromogenicassay |
| ShelfLife(properlystored) | 12months |
Theserineproteaseα-thrombinisproducedbyproteolyticactivationofthezymogen,prothrombin.Theenzymecomplex,prothrombinase,catalyzestheproteolysisoftwopeptidebondsinprothrombin,whichgivesrisetoanNH2-terminalderivedF1.2regionandtheheterodimer,α-thrombin.Alpha-thrombiniscomposedofan"A"chain(Mr=6000)whichiscovalentlylinkedtoa"B"chain(Mr=31,000)throughasingledisulfidebond.
SampleGelInformation:
| Gel | Novex4-12%Bis-Tris |
|---|---|
| Load | HumanBeta&GammaThrombin,1µgperlane |
| Buffer | MES |
| Standard | SeeBluePlus2;Myosin(188kDa),PhosphorylaseB(98kDa),BSA(62kDa),GlutamicDehydrogenase(49kDa),AlcoholDehydrogenase(38kDa),CarbonicAnhydrase(28kDa),MyoglobinRed(17kDa),Lysozyme(14kDa),Aprotinin(6kDa),Insulin,Bchain(3kDa). |
Overview:
Alpha-thrombinisahighlyspecificserineproteasegeneratedbyproteolyticactivationofthezymogenprothrombin(1).Duringcoagulation,thrombincleavesfibrinogentoformfibrin,leADIngtotheultimatestepincoagulation,theformationofafibrinclot.ThrombinisalsoresponsIBLeforfeedbackactivationoftheprocofactorsfactorVandfactorVIII.ThrombinhasalsobeenreportedtoactivatefactorXIIIandplatelets,andalsofunctionsasavasoconstrictorprotein.Theprocoagulantactivityofthrombinisarrestedintwoways:1)inhibitionbyeitherheparincofactorIIortheantithrombinIII/heparincomplex;or2)complexformationwiththrombomodulin.Formationofthethrombin/thrombomodulincomplexresultsintheinABIlityofthrombintocleavefibrinogenandactivatefactorsVandVIII,butincreasestheefficiencyofthrombinforactivationoftheanticoagulant,proteinC.
ThrombinisatwochainenzymecomposedofanNH2-terminal"A"chain(Mr=6,000)andaCOOH-terminal"B"chain(Mr=31,000)whichremaincovalentlyassociatedthroughasingledisulfidebond.Humanthrombinis13aminoacidsshorterthanthebovinethrombinduetoathrombincleavagesiteonthehumanproteinthatisnotpresentinthebovineprotein.
Thrombinisalsoutilizedforsitespecificcleavageoffusionproteinsexpressedinbacteria(9-11).Athrombinsensitivesiteisincorporatedbetweentherecombinantproteinofinterestandpeptidesorproteinswhichfacilitatepurificationand/orexpression.Thetargetproteinisreleasedfromtheexpressedhybridbycleavagewiththrombin.Thrombincanthenbeeasilyremovedbyaffinitychromatography.
Human,bovineandmousethrombinarepreparedfrompurifiedprothrombinusingamodificationoftheLundbladprocedure(1)asdescribedbyNesheimetal.(2).Thrombinissuppliedin50%(vol/vol)glycerol/H2Oandshouldbestoredat-20oC.PurityisdeterminedbySDS-PAGEanalysisandactivityismeasuredinathrombinspecificclottingassay,andcomparedtostandardizedNIHthrombin.ThrombinisalsoavailablewiththeactivesiteblockedwitheitherDFP,FPRck,orbiotinlyatedFPRck.
CleavageofFusionProteins
Inadditiontoitsbroadapplicationincoagulationresearchthrombincanbeusedforsitespecificcleavageoffusionproteins.Athrombinsensitivesiteisincorporatedbetweentherecombinantproteinofinterestandpeptidesorproteinswhichfacilitatepurificationand/orexpression.Thetargetproteinisreleasedfromtheexpressedhybridbycleavagewiththrombin.Thrombincanthenbeeasilyremovedbyaffinitychromatography.Lottolotconsistencyensuresreproducibleresultseverytime.Forexperimentsinvolvingcellcultures,pleasecontactustodiscusscustom,lowendotoxinlotsdesignatedforcellcultureuse.
Properties:
| Localization | Plasma | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Modeofaction | Serineproteasewhichcleavesfibrinogentoformfibrin;alsoresponsibleforactivationofproteinC,plateletactivationandfeedbackactivationoftheprocofactors,factorVandfactorVIII | |||||||
| Molecularweigh | 36,700(3-6) | |||||||
| Extinctioncoefficient |
| |||||||
| SpecificActivity | approximately3800NIHunits/mg | |||||||
| Isoelectricpoint | 7.0-7.6(human)(3) | |||||||
| Structure | twosubunits,approximatelyMr=6,000and31,000 | |||||||
| Percentcarbohydrate | approximately5% |
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(1)1×107细胞重悬,其来源可为新鲜样品或贮存于-80℃1mol冰冻清洗缓冲液中
的无DMSO的样品,冰冻缓冲液包括10mMHEPES(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCl,
1mM二硫苏糖醇(DTT),然后离心(16000rpm、4℃、1min)。
(2)重悬细胞团于100ul冰冻裂解缓冲液,其包含10mMTris-HCl(pH7.5),1mMMgCl2,1mMEGTA,0.1mM苯甲基磺酰氟(DMSF),5mMB2巯基乙醇,0.5%CHAPs(Pierce)和10%甘油。
(3)冰育30分,然后在超速离心机中离心30分钟。
(4)去上清,液氮速冻沉淀,裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0.1ug荧光标记的cx反转引物,蜡封(5′CCCTTACCCTTACCC
TTACCCTTA3′)。
(2)于蜡界之上加50ulTRAP反应物,包括Tris-Cl(pH8.3)20mM,1.5mMMgCl2,
63mMKCl,0.005%,TWeen20,1mMEGTA,50mM三磷酸脱氧核苷,0.1ug荧光标记
TS前导引物(5′AATCCGTCGAGCAGAGTT3′),1ugT4基因32蛋白,牛血清白蛋白0.1mg/ml,2UTaqNDA聚合酶(Takara,shyzou)和5ugCHAPs细胞提取液。荧光标记TS引物可由市场购得。扩增前5ug提取物与1ugRNA酶37℃水浴20分钟,为了端粒酶活性的标准化,运用体内端粒酶活性标准(TTAS):TS重叠引物和CX重叠引物(TS:5′AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC3′及CX:5′CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTATAGGCGCTCAATGTA3′)TS(18bp)和CX(24bp)序列为普通型,下划线标出的为成肌素序列(每个15bp)。成肌素CDNA通过这些引物扩
增产生了150bp的产物,它可用与ITAS扩增端粒酶梯度相同的TS引物和CX引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram以显现I-TAS,它并不干扰TRAP测量。
(3)置于22℃10分钟,作为TS引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90秒。
(4)PCR扩增,条件94℃30S,50℃30S,72℃1.5min;共27循环。
三、分析
(1)制备8%的变性胶(longRanger,ATBiochem)含6M尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE)于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul混合后上样,上样缓冲液含90%甲酰胺和10%蓝葡聚
糖(Bluedertian)。
(4)95℃预发性4分钟,速冷,上样,运用100bp,150bp,200bp大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由FiagmuntManager程序自动分析,每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值,一部分PCR产物应在蒸馏水稀释后再分析
这样可不可以？
另还有几个问题：1、这样的裂解液裂解线粒体提蛋白可不可以
2、裂解液加多少剂量
3、12000g离心10min和30分钟有没有区别
一、机械裂解法主要有以下两中：
1．热休克（Thermal shock）,既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成（freezing and thawing）,.原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2．超声波处理（Ultrasonication）既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法（在提核酸时联合使用）
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：
50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系）,150 mM NaCl（等渗体系）,1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂）,1 mM EDTA（变性剂和稳定剂）,5 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂）,5 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂）,1% Triton x-100（破坏细胞）,1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂）,0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）.7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解）,蛋白酶K等.
【2】加入裂解液后可以加用超声破碎细胞。
【3】提完细胞的器具可以在显微镜下看一下，剩余的细胞还多不多。如果还多，说明细胞提取的不彻底，还要改进方法，争取提取的细胞彻底一些。
（仅供参考）
我的邮箱：maoyuanqing@citiz.net
不知单纯使用冰浴中超声裂解够了吗？还是说要选用裂解液呢？最主要的就是我不知道该怎么赔这个裂解液，使其COX活性不产生影响
样品处理：
a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。
b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。
d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。
e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。
将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。
2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。
吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃ 12000rpm离心2min，弃废液。7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃ 12,000 rpm离心2min，弃废液。9. 12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。10. 将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到RNA。
注意事项：
所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯，需电泳检测。
