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biomax/LC2165 Non-small cell lung cancer NSCLC tissue array (all samples are from 2006 to 2012), including TNM and pathology grade, with ALK results, 108 cases/216/LC2165
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biomax/LC2165 Non-small cell lung cancer NSCLC tissue array (all samples are from 2006 to 2012), including TNM and pathology grade, with ALK results, 108 cases/216/LC2165
品牌 / 
biomax
货号 / 
LC2165
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Microarray PanelNon-small cell lung cancer tissue microarray, containing 42 cases squamous cell carcinoma, 54 adenocarcinoma, 8 adenosquamous carcinoma and 4 mucinous adenocarcinoma, duplicate cores per case
Cores216
Biomax.us Tissue Array LC2165
Cases108
Row number12
Column number18
Core Diameter (mm)1
Thickness (µm)5
Tissue Array TypeFFPE
SpeciesHuman
ApplicationsRoutine histology procedures including Immunohistochemistry (IHC) and In Situ Hybridization (ISH), protocols which can be found at our support page.
Notes1. TMA slides were sectioned and stored at 4°C and may not be fresh cut, but still suitable for IHC. Please request fresh cut if experiment involves phospho-specific antibodies, RNA studies, FISH or ISH, etc. A minimum of 3 slides per TMA must be purchased to cover the cost of trimming for fresh sectioning.2. Most TMA slides were not coated with an extra layer of paraffin (tissue cores can be easily seen on the glass). To prevent tissue detachment during antigen retrieval, unbaked slides must be baked for at least 30 to 120 minutes at 60°C. before putting into xylene for de-paraffinization. Baked slides were sent out baked for 2 hours.In the following specsheet,“*” means invalid core; “-” means no applicable or negative in IHC markers.
Mouseover and click individual cores to view high resolution images.
Slide Label: US Biomax, Inc. Tissue Array
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2021-09-12
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各位同仁大家好,最近在尝试利用CRISPR/cas9技术敲除基因,苦于手里头资源有限,只有lentiCRISPRv2以及相应的包装体系,没有pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0,无奈公司货期较久,想立刻开展实验,不知哪位同仁有此质粒并愿意交换,不甚感激。


相关疾病:单纯疱疹病毒感染先天性卵巢发育不全综合征年龄相关性黄斑变性视网膜脱离青光眼白内障RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程,是生物进化过程中保留下来的基因表达调控......
我自己尝试做了好几次基因敲除,效果都不好,想着干脆直接送出去算了,不知道行不行?
1.什么是CRISPR/Cas9?
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年,发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵;08年,发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白(参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体,发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点:

构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点:

严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶(前两代分别是ZFN和TALEN),用于复杂基因组的编辑,目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶,在DNA的特定位置制造单链切口,这样不会引起非同源末端连接,但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面:

基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除


近期,北京大学基础医学院鲁凤民教授课题组与许中伟、夏宁邵教授等合作,在《Theranostics》杂志上在线发表了题为“ThegRNA-miRNA-gRNAternarycassettecombiningCRISPR/Cas9withRNAiapproachstronglyinhibitshepatitisBvirusreplication”的研究论文。该研究通过模拟microRNA(miRNA)的生成过程,整合双gRNA导向的CRISPR/Cas9和RNA干扰技术,高效破坏乙型肝炎病毒(HBV)的复制模板-共价闭合环状DNA(ccCDNA),探索病毒清除新路径。北医王杰讲师、陈然和张瑞阳博士研究生为该论文的共同第一作者。

目前,我国仍有慢性HBV感染者约7800万人,慢乙肝患者约2800万人。HBV感染仍是我国病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作为HBV复制模板的cccDNA,由于其半衰期相对较长,加上cccDNA池的不断补充,使得细胞核内的cccDNA持续存在、感染慢性化。目前,临床上治疗慢乙肝的常用药物为核苷(酸)类似物和长效干扰素,二者均不直接作用于cccDNA,难以有效清除病毒实现临床治愈。因此,研发直接靶向cccDNA的药物,寻找清除cccDNA的新方法和新策略,是当前慢乙肝治疗药物研发的热点。

该研究以miRNA-31为基本骨架,通过模拟其核心序列的二级结构设计HBV特异的miRNA(miR-HBV),miRNA两侧侧翼序列为特异性靶向cccDNA不同位点的引导RNA(gRNA)。如图所示,该gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联体表达体系导入细胞后,在细胞核内转录形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA长转录本,经内源的Drosha/DGCR8复合体剪切,形成2个gRNA和1个miR-HBV前体(pre-miR-HBV)。进入细胞质后,pre-miR-HBV进一步经Dicer酶剪切,形成成熟的miR-HBV。一方面双gRNA导向的CRISPR/Cas9系统通过切割并去除cccDNA的关键调控和编码序列直接破坏cccDNA,另一方面通过miR-HBV在转录后水平抑制HBV复制,进而抑制cccDNA池的补充,协同促进HBVcccDNA的清除。此外,本研究还发现,当pri-miRNA-31的侧翼序列长度为38bp时与双gRNA组成的三联体对HBV复制的抑制效率最高。

双gRNA导向的CRISPR/Cas9整合RNAi技术高效抑制HBV复制模式图

当然,该技术离临床应用尚有较远的距离。一方面如何高效和靶向性地将三联体递送到HBV感染的肝细胞内是需要攻克的一大障碍;另一方面,CRISPR/Cas9基因编辑技术的脱靶效应也有安全性之虞。然而,近年来随着Cas核酸酶的不断改造,其脱靶效应得到了有效控制,安全性大为提高。而且,随着金黄色葡萄球菌Cas9的发现,使得CRISPR/Cas9系统可以装入腺相关病毒载体中,致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。

总之,本研究通过gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联表达框架联合CRISPR/Cas9和RNA干扰技术高效破坏cccDNA,促进HBV清除,为慢乙肝抗病毒治疗提供了新的思路。该项研究得到国家十二五重大科技专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”项目和国家自然科学基金的支持。

论文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466


这要具体分析,如果这个基因存在可变剪接,那就看这个基因是否有外显子(不为三的整倍数的外显子)是这些转录本里共有的,如果是就可以在这个外显子上设计sgRNA,这样就可以敲除掉这个外显子和其后的外显子(因为移码突变导致的提前翻译终止)。如果没有这样的外显子那就只能在不同的外显子上设计多条sgRNA,然后筛选这几个转录本都敲除成功的细胞系或实验动物就可以了(毕竟应用Cas9技术能够实现多基因敲除)。
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3
类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前,来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含
有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的
DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统。
这是个理解的问题目的基因与质粒结合利用了碱基互补配对但质粒进入受体细胞不需要碱基互补配对即使整合到染色体的dna上你也只能说整合过程利用了碱基互补陪读而不是那个导入过程
脂质体的转染毒性是最大的,很明显,那么多的细胞死亡是由于转染的细胞毒性导致的。对于这一点我有两个建议,一个是减少DNA的用量,我一般做转染,对于任何细胞,只要是12孔板,一般都是用1ugDNA,这个量绝对够了。,因为质粒转染进入细胞的本质,和病毒感染没区别,质粒的各种元件会从宿主细胞内抢夺细胞机器大量开始转录翻译你的目的蛋白,在这个过程中会产生大量的没有正确折叠蛋白,这些异常折叠蛋白进一步引起ER stress导致细胞凋亡。因此你用DNA太多,本身就有细胞毒性。另外就是脂质体本身的毒性。事实上,对于293系的细胞系,最好用的是PEI这种东西。毒性小,转染效率高,一般对293系列的细胞系可以轻易达到80%。polyscience有粉末买,买回来后直接在分子纯度的水里配置成1ug/uL的溶液,和你的质粒按照1ug DNA/6ug PEI对293进行转染。
而且直接使用自制的PEI非常便宜,在293上远比商品化的脂质体要好。

另外,如果你们实验室确实钱多,不怕花钱,建议你取用Promega的FugenHD,那个转染效率比脂质体更好,而且毒性小,至于价格。。。。。。。。。。。也更高。。。。。。。。。

另外,你说漂浮的细胞有表到GFP,那个不一定是真的GFP,很多时候
哪里可以做CRISPR/Cas9基因敲入小鼠,有谁做过
是的,确切来说是大量表达。 大肠杆菌是基因重组技术中常用的细菌,将外源目的基因(如人胰岛素基因)导入大肠杆菌后可在大肠杆菌内表达目的蛋白(如胰岛素),由于细菌繁殖速度快,通过发酵便可在短时间内获得大量胰岛素,再经多步分离、纯化便得到了药用胰岛素。
流程大概是这样的:首先获得小鼠ES细胞系,测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体,将打靶载体转入一定数目ES细胞中,然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,从而得到带有修饰基因的突变小鼠,而后可以对其进行表型分析。
Crispr/cas9是第三代基因敲除技术,上半年频繁发表于Science,Nature等杂志。由于老板有想法做基因敲除,现在在研究这方面的文献。发现其中有很多问题,本人研二,吧里有没有其他人感兴趣。一起交流!QQ415968281
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