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你这个结论并不对。两步法，三步法并没有本质区别，信号的读取都是在每一个延长结束后读取。定量PCR一开始的时候也是三步法的。

两步法，是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度，而且定量PCR的产物都很短，需要的时候都短，所以两步法更方便。三步法的话，花的时间长，不利于快速实验。

本人利用总RNA做NASBA一直没有扩增结果求帮助
下图是NASBA的实验结果图
1-Markerds2000
2,3为平行试验其RNA的浓度均为10X4
4为只有模板的RNA样品的对照

伯乐的不错，实验目前用的就是这块，产品质量可以

操作方法?
原理?(没有就算了...)
答的好的提高悬赏50分
有原理的追加50分
谢谢啊~~~~

最近要做realtimePCR，taqman探针法，没有买市场上的产品，可否先用普通taq酶试试？
这样设想的前提是因为，普通Taq酶也具有5‘－3’外切酶活性，如果可以的话，与普通PCR相比，反应体系需要做什么样的改动呢？
用的是ABI的机器。

交叉引物恒温扩增技术
核酸扩增是核酸分子诊断的关键技术。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是PCR核酸扩增技术，另一类是核酸恒温扩增技术。
PCR技术是指通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤：模板变性（如95℃）－引物杂交（如58℃）－DNA合成（如72℃）。这种温度变化的循环重复（如重复35次）过程通常由精密而复杂的仪器（PCR仪）来控制。核酸恒温扩增技术（NucleicAcidIsothermalAmplification，NAIA）则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行，不须象PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程。这一特点使得它们对扩增所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的应用价值，成为分子诊断行业发展中的热点。
目前的NAIA技术主要有滚环扩增技术（RollingCircleAmplification，RCA）、转录酶扩增技术(TranscriptionMediatedAmplification，TMA)、依赖核酸序列扩增技术(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、链置换扩增技术(stranddisplacementamplification，SDA)、环介导的等温扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP）、解链酶扩增技术（HelicaseDependentAmplification，HDA）。上述各种核酸扩增技术均由国外公司所拥有。
交叉引物扩增技术（CrossingPrimingAmplification，CPA）是完全由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。CPA与优思达公司其他技术相结合(如快速核酸提取技术、核酸试纸条检测技术等)，形成一个完整的现场快速分子检测平台，可以开发出众多恒温扩增检测试剂盒，广泛应用于分子诊断、防疫检疫、生物医学研究、个体化治疗等领域。该技术已申请中国和美国发明专利，在美国《MolecularDiagnostics》等杂志发表论文二篇，并通过了比尔?盖茨基金会资助申请。
CPA扩增体系中除包含具有链置换功能的BstDNA聚合酶外，还主要包括扩增引物和两条交叉引物。这些寡聚核苷酸链能依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现。CPA扩增主要包含以下几个步骤：
交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补，启动DNA合成，使得PRa被引入到所扩增的产物中;
外围引物DP1s与PFa前端DP1a序列互补，通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物（结构3），一边与模板DNA形成双链产物（结构2）;
在结构3中，DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，置换出由CPR所延伸的单链产物（结构5），同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物（结构4）,而结构5相对起始的DNA模板，多了PRs和PFs两个片段序列;
单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合，可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域（结构8）;
因此，扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸，不仅使得结构5的长度不断的加长,从而引入更多CPF和CPR3’端互补区域，同时也置换出了各种可与CPF和CPR3’端互补的单链产物;
通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用，使得DNA拷贝数不断的增加，从而达到基因扩增的效果。
使用本装置提取临床生物样品的核酸成本低廉，只需几分钟，可以应用于现场检测或实验资源较少的基层医院和经济不发达地区；同时也可以满足大医院特定情况下的需求，如急诊或床边的核酸快速诊断。该技术已申请发明专利，并取得盖茨基金会研发资助。
CPA基本原理如下：

图2CPA扩增的反应原理图
与目前广泛使用的荧光PCR技术相比较，CPA技术有以下几个优点：
反应速度快：反应时间约1小时，使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断（Point-of-Testing,POCT）；
检测成本低：目前荧光光定量PCR仪价格昂贵，无法在很多中小医院普及。CPA扩增只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，即可进行扩增。
操作简单：对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。

各位大侠好！我最近在做滚环扩增的时候遇到问题了，来和大家讨论一下，希望各路高手不吝赐教！
我做的是用锁式探针来检测dna模板的ram，探针80base，其中杂交区40base，引物分别为16、18base，连接酶选取的T4 ligase和Taq DNA ligase两种，分别对应恒温和变温情况下的扩增。水解体系为EXO I和Exo Ⅲ的混合体系，参考的外文文献，应该没什么问题。聚合酶用的是Bst DNA大片段聚合酶。
一开始选择的探针浓度为200pmol/L，扩增效果挺好，当时用的DNA模板是质粒阳性标准品，但是后来在做敏感性的时候发现条带梯度差异几乎没有，而且阴性也出带，后来就没法做敏感性和特异性验证了，实验停滞了2个月一直也没进展。
按理说RAM借助锁式探针扩增的独特方式以及水解体系的存在可以有效防止污染才对，希望大家给点建议该如何解决。
万分感谢！！！！！！！！！！
附一张以前做敏感性的图（marker为2000的DNA ladder）以做参考

这几天一岁的闺女得手足口病，医院让查这个，荧光定量是查什么的？有什么用啊？尽量说的直白一点，完全不懂啊！

PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
数字PCR(Digital PCR)仪器　　伯乐生命bio-rad QX200 微滴式数字PCR (ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。　　QX200 Droplet数字PCR(Digital PCR) 系统的应用领域：　　癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析　　以卓越的灵敏度和准确度测量癌症突变的变异程度、检测稀有的 DNA 靶拷贝以及解析拷贝数变异状态。　　病原体检测　　精确地对靶 DNA 或 RNA 分子中的细微变化进行定量分析，从而检测和监测病原体。　　与新一代测序 无缝对接　　无需使用标准曲线，直接对 NGS 库执行绝对定量分析。　　基因表达分析　　可对少量 mRNA 和 miRNA 的细微变化进行准确及重复性极佳的检测。　　环境监测　　使用 QX200 系统可测试多种环境样品，例如土壤和水。　　食品检测　　采用经过验证的 ddPCR 方法对转基因生物体 (GMO) 进行评估。向左转|向右转

常规PCR一般注意点：
1）PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平

2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.

3）首先是你的TAQ酶要在冰上操作，以免失活（Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果），TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱，注意不要污染，PCR完成后要及时从PCR仪取出（如果你的PCR仪没有保温功能），如果你放在外面时间较长可以放－20度冰箱（尤其片段比较小时）。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,

4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度

PCR实验中出现的问题及对策：
一、非特异性条带
原因：1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策：1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高，建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多，建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多，建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低，以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度，范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件，很难摸出时可以使用降落PCR，普通的9600PCR仪也可以做，只是程序麻烦些。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法，减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加，当然可以做个简易冰盒，直接在94度放入样本到机器，效果不错。
6、Template量过多，Template量以20%递减。PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短，30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象：扩增带时有时无，出现时与国外文献中的照片相似，不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法：换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果（虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果，但实在是万般无奈），把各引物单独或者两两结合进行试验，时好是坏。
3.思考：第一点，是否是管子的问题？管子的质量不是很好（为了便宜），特别是外形不是很规矩，与扩增仪上的管孔结合不紧密，又不经常加油，而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢？第二点，那么是否是变性温度较高使酶过早的失活？虽然扩增的产物很弱，但分子量是相符的，说明扩增在进行，只是产物量较少，这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决：将变性温度由文献的95℃改为94℃，问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照：加的是“水”——出现“区带”
待检样品：加的是“模板”——无“带”
说明：1，水被污染
2，模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天，还可以扩出来，意外时不要扔还可以做一次啊

PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1）对于需要存放的试剂、样品，都有明确的标签，套小的密实袋，离心管上有品名、浓度、日期，在密实袋上会重复写一次；
2）实验记录上还会记下新来试剂的存放日期；
3）用成品试剂盒时，除了会在实验记录上记下某日用量多少，还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。

2、管子放置
做大批量PCR用八连管，八连管的盖子有一端有缺口，有缺口的那段向着自己，有时碰到盖好后没有拿稳掉下来，也能准确无误的分清楚前后次序。

3、准备工作
实验之前，试剂器皿仪器都准备妥当，且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查，确认无误后，就快速准确的动手实验。
1）酶和dNTP最好分装．
dNTP的质量与浓度:　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
2）PCR前，将枪等物品放在超净台中，用紫外照射半小时，可以破坏DNA，防止气溶胶污染等。但是，PCR不一定非要在超净台进行，如做质粒PCR就不那么严格．
3）PCR时，试剂化冻后，都稍稍振荡（手弹或者颠倒混匀），离心后再取（通常几秒钟，当转速到2000转左右关离心机）。（1）较均匀；（2）盖上沾的试剂被离下，不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前，混匀的时间要稍长些。
4）PCR反应体系需要在冰上进行配制，以免酶失活或者核酸降解，反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5)，两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键，先设置好PCR的程序然后再去配体系，别配好体系才想起PCR仪还没开。

5、加样：
1》、加样顺序
1）按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶－水这个顺序加,不易起泡.
2）或加样顺序倒没有特别要求，只是Taq酶要注意最后加，加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3）或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少，很宝贵，避免DNA间的污染就要首先考虑：第一步先加水，第二步就紧接着加DNA，这样加相同DNA就可以不换TIPS，又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物，缓冲体系和酶就要重点保护？？？，先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性，如PyroBest，pfu，就必需把酶放到最后加，否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR，可先加一起，再用枪分取
比如要做n管，就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好，然后再分装，如：
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板，就把除模板外的其他成分乘10，即buffer50ul，dNTP40ul，引物110ul，引物210ul，taq酶10ul，ddw340ul，加到一个离心管中，加盖，用力振荡使混匀（这步是必要的，否则分到各管中的体系不均匀），稍稍离心一下，然后分装至9个PCR管中，每管48ul，再依次加入模板2ul，混匀，稍稍离心，上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1）枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多)，若看见有一个小水滴掉进去，证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加，可能加进空气。所有的试剂都加完后，要用枪混匀，然后用手动离心机离一下，使之没有气泡，不要用手剧烈震荡tube
2）枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心)，否则使某些物质的量减少，所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法，也就是加样时沿着管壁螺旋式上升，等全部加完后离心混匀，如果有气泡，用手指轻轻弹几下，气泡就没了（有时ep管内有气泡，反正p时要加温，发现最后结果相差不大），而且确保液体都在管底。
3）在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时，加在管壁，而不是管底，在管壁形成一个小液滴，每个小液滴都孤立存在，用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1）事先列出清单，准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2）少量加样时，可以把试剂分别先加到EP管壁，这样不仅可以确定是否加上了试剂，还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确；
3）加样时，将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧，加完的转移到另一侧。
4）将PCR试剂放在最右边的竖排，再将EP管从左边开始横排放，在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排，这样就可以清楚的区分哪些管加了
5）还有如没有太大影响的话，将加完的合上盖子，没加的盖子打开。
6）泡沫（软的那种）制作了个板子，把ep管放上去，在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度：
1）试剂完全化后再加样，浓度准确。像镁离子，融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2）各种酶，用之前瞬时离心一下，如果买的大包装的，最好分装一下，以避免反复冻融。
3）试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密，否则误差将会很大；
7》、枪头：枪头要买好的，不然你有好枪也没用。

恒温PCR一种新式恒温核酸扩增方法，其原理是采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，反应全过程恒定63℃，不到1h的时间里进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109个～ 1010个拷贝数量级。在扩增反应中产生茎-环结构，保证引物与其杂交启动新一轮核酸合成。配合恒温荧光检测设备可实时监测扩增情况。该扩增法具有简单、快速、准确、易检测、适用面广等优点。迪澳转基因快速检测箱，配置了高通量恒温荧光检测仪DEAOU-308C、转基因快速检测试剂、植物基因组核酸提取试剂及必备的实验耗材。为客户提供了精确高效、功能全面、经济实用的转基因检测手段。

主要是该方法使用了Bst酶，双链的DNA有一个特性，就是在65度时双链之间的结合较为松散，称之为动态平衡状态，所以不需要预变性使双链解开，而Bst酶在65度时的活性是最高的，这样LAMP反应就能正常进行了