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实时荧光定量PCR溶解曲线杂乱是什么原因？调退火温度有用吗？怎么能改善啊

常规PCR一般注意点：
1）PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平

2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.

3）首先是你的TAQ酶要在冰上操作，以免失活（Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果），TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱，注意不要污染，PCR完成后要及时从PCR仪取出（如果你的PCR仪没有保温功能），如果你放在外面时间较长可以放－20度冰箱（尤其片段比较小时）。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,

4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度

PCR实验中出现的问题及对策：
一、非特异性条带
原因：1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策：1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高，建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多，建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多，建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低，以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度，范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件，很难摸出时可以使用降落PCR，普通的9600PCR仪也可以做，只是程序麻烦些。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法，减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加，当然可以做个简易冰盒，直接在94度放入样本到机器，效果不错。
6、Template量过多，Template量以20%递减。PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短，30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象：扩增带时有时无，出现时与国外文献中的照片相似，不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法：换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果（虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果，但实在是万般无奈），把各引物单独或者两两结合进行试验，时好是坏。
3.思考：第一点，是否是管子的问题？管子的质量不是很好（为了便宜），特别是外形不是很规矩，与扩增仪上的管孔结合不紧密，又不经常加油，而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢？第二点，那么是否是变性温度较高使酶过早的失活？虽然扩增的产物很弱，但分子量是相符的，说明扩增在进行，只是产物量较少，这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决：将变性温度由文献的95℃改为94℃，问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照：加的是“水”——出现“区带”
待检样品：加的是“模板”——无“带”
说明：1，水被污染
2，模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天，还可以扩出来，意外时不要扔还可以做一次啊

PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1）对于需要存放的试剂、样品，都有明确的标签，套小的密实袋，离心管上有品名、浓度、日期，在密实袋上会重复写一次；
2）实验记录上还会记下新来试剂的存放日期；
3）用成品试剂盒时，除了会在实验记录上记下某日用量多少，还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。

2、管子放置
做大批量PCR用八连管，八连管的盖子有一端有缺口，有缺口的那段向着自己，有时碰到盖好后没有拿稳掉下来，也能准确无误的分清楚前后次序。

3、准备工作
实验之前，试剂器皿仪器都准备妥当，且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查，确认无误后，就快速准确的动手实验。
1）酶和dNTP最好分装．
dNTP的质量与浓度:　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
2）PCR前，将枪等物品放在超净台中，用紫外照射半小时，可以破坏DNA，防止气溶胶污染等。但是，PCR不一定非要在超净台进行，如做质粒PCR就不那么严格．
3）PCR时，试剂化冻后，都稍稍振荡（手弹或者颠倒混匀），离心后再取（通常几秒钟，当转速到2000转左右关离心机）。（1）较均匀；（2）盖上沾的试剂被离下，不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前，混匀的时间要稍长些。
4）PCR反应体系需要在冰上进行配制，以免酶失活或者核酸降解，反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5)，两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键，先设置好PCR的程序然后再去配体系，别配好体系才想起PCR仪还没开。

5、加样：
1》、加样顺序
1）按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶－水这个顺序加,不易起泡.
2）或加样顺序倒没有特别要求，只是Taq酶要注意最后加，加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3）或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少，很宝贵，避免DNA间的污染就要首先考虑：第一步先加水，第二步就紧接着加DNA，这样加相同DNA就可以不换TIPS，又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物，缓冲体系和酶就要重点保护？？？，先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性，如PyroBest，pfu，就必需把酶放到最后加，否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR，可先加一起，再用枪分取
比如要做n管，就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好，然后再分装，如：
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板，就把除模板外的其他成分乘10，即buffer50ul，dNTP40ul，引物110ul，引物210ul，taq酶10ul，ddw340ul，加到一个离心管中，加盖，用力振荡使混匀（这步是必要的，否则分到各管中的体系不均匀），稍稍离心一下，然后分装至9个PCR管中，每管48ul，再依次加入模板2ul，混匀，稍稍离心，上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1）枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多)，若看见有一个小水滴掉进去，证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加，可能加进空气。所有的试剂都加完后，要用枪混匀，然后用手动离心机离一下，使之没有气泡，不要用手剧烈震荡tube
2）枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心)，否则使某些物质的量减少，所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法，也就是加样时沿着管壁螺旋式上升，等全部加完后离心混匀，如果有气泡，用手指轻轻弹几下，气泡就没了（有时ep管内有气泡，反正p时要加温，发现最后结果相差不大），而且确保液体都在管底。
3）在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时，加在管壁，而不是管底，在管壁形成一个小液滴，每个小液滴都孤立存在，用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1）事先列出清单，准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2）少量加样时，可以把试剂分别先加到EP管壁，这样不仅可以确定是否加上了试剂，还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确；
3）加样时，将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧，加完的转移到另一侧。
4）将PCR试剂放在最右边的竖排，再将EP管从左边开始横排放，在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排，这样就可以清楚的区分哪些管加了
5）还有如没有太大影响的话，将加完的合上盖子，没加的盖子打开。
6）泡沫（软的那种）制作了个板子，把ep管放上去，在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度：
1）试剂完全化后再加样，浓度准确。像镁离子，融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2）各种酶，用之前瞬时离心一下，如果买的大包装的，最好分装一下，以避免反复冻融。
3）试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密，否则误差将会很大；
7》、枪头：枪头要买好的，不然你有好枪也没用。

你所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reversetranscription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtimefluores-cencequantitativePCR）也简称RT-PCR，但是我觉得这是不对的，不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-TimePCR，原理有点多，请自行百度百科，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。向左转|向右转

实时荧光定量PCR即
Real time PCR(也称实时定量PCR)
定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。
实时荧光定量PCR 技术的主要应用：
1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等
2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证
3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等
Realtime PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）
SYBR green
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
此方法适用：
1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上
2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。
3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。
4、高通量大规模的定量PCR检测
5、专一性要求不高的定量PCR检测。
Taqman Probe
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
此方法适用：
1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。
2、适用于扩增序列专一的体系的检测。
3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。
4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。
5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。
6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。

数字pcr为什么对抑制剂不敏感
在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digital PCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

色谱分析做系统适用性试验主要是为了确定分析使用的色谱系统是有效的、适用的。系统适用性通常用四个参数来确定系统的适用性：分离度、柱效、重复性和拖尾因子。
　　其中分离度和柱效是二个最重要、也更具有实用意义的参数。分离度是判断两物质在一个方法中分离的程度，虽然与柱效相关，但在衡量系统适用性时，首先强调的应该是分离度，只有当色谱图中仅有一个色谱峰或测定微量成分时，规定柱效才有其特殊重要性。重复性和拖尾因子，分别对重现性和色谱峰的峰形做出了要求。重现性保证了方法的可重复性，对柱效能提出了要求，柱子老化、塌陷，拖尾因子则难以达到要求
数字PCR 和色谱分析系统及中高压层析系统提醒你：
色谱分析以分离出来时间位置来判断是何种物质，以峰的积分面积来分析其含量。色谱分析法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。 ---即是一种分析方法

色谱分析系统，是基于色谱分析法的一种分析仪器，如：液相色谱、气相色谱、离子色谱、凝胶色谱等。

PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，即聚合酶连反应，是一种扩大和复制目的片段DNA的技术，其发现对于生命科学的发展具有重要的意义。而3D数字PCR到底是什么鬼？它其实是最新出现的一款PCR仪，其具有对目的DNA分子做出绝对定量的优点，进而提供无与伦比的准确性、灵敏度。原理3D数字PCR是基于纳米流体芯片进行检测，通过一次检测，将样品分到数千个单独的PCR，检测结果部分为阳性，部分为阴性，之后进行绝对分子数统计，不需做标曲。目前可检测到2万个0.8nL的液滴（样品），能够精确的进行靶位点进行绝对定量研究。应用前景基因表达的绝对定量应用该技术，实现对DNA进行精确绝对定量，精确度可通过复制次数实现。通过准确性的进行定量检测基因，有助于临床上在治疗癌症、病毒感染等疾病作参考。同时，其具有高通量，检测速度快，成本相对低等优点，为后期精准治疗奠定基础。罕见基因的检测对于临床上的罕见的基因进行检测，不依靠参考标准，节约样本与试剂，并具有一定的精确度。3D数字PCR为液体活检提供技术支持液体活检是一种非侵入性的检测肿瘤基因及临床治疗效果的一种方法，目前可能正在开展有关3D数字PCR在在液体活检中的疗效，为后期临床提供更多可靠的指导作用。最新报道称“无创伤性肺癌检测技术即将登陆中国”。随着基因检测技术，如类似3D数字PCR技术的发展，推动我们将进入了“DNA的应用商城”这样的新时代，如23 and me、华大基因等专业的检测服务机构，提供更加专业的基因检测结果，经基因报告解读师或遗传咨询师进行通俗的解读，让我们每一个人都能够了解自己的基因，拥有自己的“生命之书”，让我们更加健康的生活。精准医疗其实本质是应用生物学信息与大数据科学的交叉发展的新型医学概念与医疗模式。对于精准医疗，重点在于“精准”，不仅仅是简单的基因测序如此简单，更需要精准的诊断与精准的治疗。

比较简易的装置，可携带。但是通量小

PCR相关技术问题，可搜索oneshine，在交流专区，有比较全面的技术信息，希望能帮到你

结果如图。A到E都是一个样本，A123是gapdh，后面共有18种引物。f到h是另一个样本，前三个是gapdh，后面是11种引物。结果是这样的没有起跳。。样本和引物之前做都没有问题。。做这次pcr，我只是在加样完毕到上机器之间有一个多小时在外面，前几十分钟在--20度冰箱。后20分钟在冷库解冻。放冷库的时候，用橡胶手套盖住遮光。不知道是不是这里出了问题。希望能有大神指点。
另外还有几个问题。就是跑出来的结果RFU居然有负值，这是怎么回事呢？几乎在0附近，但是在溶解曲线求导前的那个曲线。RFU又是从2400+开始下降的，这是为什么呢？

主要是该方法使用了Bst酶，双链的DNA有一个特性，就是在65度时双链之间的结合较为松散，称之为动态平衡状态，所以不需要预变性使双链解开，而Bst酶在65度时的活性是最高的，这样LAMP反应就能正常进行了