
DNA Polymerase I, Klenow Fragment (Large Fragment) is a proteolytic product of E. coli DNA Polymerase I, which possesses the 5"→3" polymerase and 3"→5" exonuclease activities of intact DNA Polymerase I, but lacksthe 5"→3" exonuclease activity of full-length DNA Polymerase I. The lack of 5"→3" exonuclease activity enables the DNA Polymerase I, Klenow Fragment to be used in random primer labeling and DNAsequencing experiments in addition to second-strand cDNA synthesis. The enzymeis supplied in a buffer of50 mM potassium phosphate (pH 6.5), 1 mmDTT and 50% glyerol (2140A/B) or ethylene glycol (2140AK/BK).
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下面是六种不同耐热聚合酶的比较:
Taq:扩增效率最高的耐热DNA聚合酶,能很好的扩增6kb以下的DNA片段。扩增碱基出错率为10-5左右。
Pfu:目前保真度最高的耐热DNA聚合酶,碱基出错率为10-6,但扩增效率低于Taq酶,一般能很好的扩增2kb以下的片段。
TaqPlus:集扩增效率高和保真度好于一身。扩增效率比Pfu高,保真度比Taq好。能有效的扩增10kb以下的片段。
HotstartTaq:经过化学修饰的耐热DNA聚合酶。此酶在常温下,活性被化学基团封闭,要在94℃-95℃加热数分钟才能回复正常活力开始反应,避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增,提高了反应的灵敏度和特异性。
LongTaq:具有3’-5’外切酶活性的耐热DNA聚合酶,它不但扩增效率高而且错配率低,对于简单模板可扩增长达40kb的模板,对复杂模板也可扩增长达15kb的片段。
TaqPlatinum:热启动高保真耐热DNA聚合酶。如果对保真度要求很高,而用Pfu扩增有难度,可选用TaqPlatinum,一般扩增长度可达4kb。
根据不同的实验目的选择最合适的酶,
克隆普通长度的目的DNA片段:Taq、TaqPlus
保真度要求较高,片段比较短,如点突变、基因筛选等:Pfu、TaqPlatinum
高保真长片段扩增,如构建基因图谱及分子遗传学研究等:LongTaq、TaqPlus
扩增基因组模板,需要降低背景:HotstartTaq、TaqPlatinum
扩增GC含量较高或二级结构较复杂的模板:TaqPlus、LongTaq、TaqPlatinum
实时荧光定量PCR反应:Taq、HotstartTaq、TaqPlatinum
从菌株或质粒模板,筛选鉴定目的克隆,扩增6kb以下的片段:Taq、TaqPlus、2×TaqPCRMasterMix
模板比较复杂或目的片段丰度低,用普通Taq酶扩增不出条带:2×TaqPCRMasterMix、2×PfuPCRMasterMix
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶;(2)依赖RNA的DNA聚合酶;(3)依赖DNA的RNA聚合酶;(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶,它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ,PolⅡ和PolⅢ等);DNA聚合酶只能在有引物的基础上,即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸,这DNA的合成方向记为5′→3′。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外,还需要Mg2+ 、模板DNA和引物,迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样,上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶,它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物,并需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下,在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′,5′-磷酸二酯键,其新生链的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105,由5条多肽链组成,分别命名为α,α,β,β′,和γ,全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大于5×105,由10~12个大小不等亚基组成。聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外,在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。向左转|向右转
DNA连接酶作用于基因工程,用于连接两个DNA片段间的磷酸二酯键。
不同点:
1、作用底物不同。RNA聚合酶底物是NTP;DNA聚合酶底物是dNTP。
2、RNA聚合酶作用不需要引物,而DNA聚合酶作用需要引物。
3、RNA聚合酶本身具有一定的解旋功能,而DNA聚合酶没有,当需要解开双链的时候要解旋酶和拓扑异构酶的帮助。
4、RNA聚合酶只具有5‘到3’端的聚合酶活性,而DNA聚合酶不仅有5‘到3’端的聚合酶活性,还具有3‘到5’端的外切酶活性。保证DNA复制时候校对,所以复制的忠实性高于转录的。
5、RNA聚合酶通常作用于转录过程;DNA聚合酶通常作用于DNA复制过程。
再来说真核生物,真核生物的DNA聚合酶分为α,β,γ,δ,ε,.首先我来说三个和原核生物中的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ功能相同的酶.ε类似于原核生物DNA聚合酶Ⅰ,β类似于原核生物DNA聚合酶Ⅱ,δ类似于原核生物DNA聚合酶Ⅲ.α具有引物酶活性,而γ则是作为复制真核生物线粒体内的DNA所需要的酶.
B、酶大部分是蛋白质、少量是RNA,故某种酶的基本组成单位是氨基酸或核糖核苷酸,B错误;
C、内分泌细胞能产生激素,活的细胞能产生酶,故能产生激素的细胞就能产生酶,C正确;
D、酶通常是蛋白质,蛋白质在低温条件下更加稳定,利于保存,而且低温不会使酶失活,因此在最适温度保存没有意义,D错误.
相同点:都能以DNA为模板,从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点
1、作用底物不同。RNA聚合酶底物是NTP;DNA聚合酶底物是dNTP。
2、RNA聚合酶作用不需要引物,而DNA聚合酶作用需要引物。
3、RNA聚合酶本身具有一定的解旋功能,而DNA聚合酶没有,当需要解开双链的时候要解旋酶和拓扑异构酶的帮助。
4、RNA聚合酶只具有5‘到3’端的聚合酶活性,而DNA聚合酶不仅有5‘到3’端的聚合酶活性,还具有3‘到5’端的外切酶活性。保证DNA复制时候校对,所以复制的忠实性高于转录的。
5、RNA聚合酶通常作用于转录过程;DNA聚合酶通常作用于DNA复制过程

