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研究称DNA修饰可控制个体恐惧感来自昆士兰大学昆士兰脑研究所的神经学家或许发现了控制个体产生恐惧感的方法对许多人来说，类似乘坐飞机或看到蜘蛛在地板上爬过这样的经历，并不只是简单地导致心跳加速和手心出汗，而是已经成为严重的恐惧症，能带来沉重的焦虑。近日，一个国际研究团队的论文指出，他们或许发现了通过DNA修饰来控制个体恐惧感的方法。
昆士兰大学昆士兰大脑研究所（QBI）的高级研究员、神经科学家TimothyBredy博士称，研究团队阐明了如何缓解与恐惧相关的记忆，特别是在恐惧症或创伤后精神压力障碍的病例中。
TimothyBredy博士称，他们已经发现了与消除恐惧有关的基因调控新机制。这种机制是一种抑制性的学习过程，当无需做出反应的时候，这一过程对于控制个体的恐惧至关重要。Bredy说：“基因运作的方式并不是静态的，而是动态变化的，能随着我们每天的生活经验而改变，与情绪有关的事件会产生显著的影响。”
通过了解在不改变内在序列的前提下改变DNA功能的机理，可以为未来开发与恐惧相关的焦虑症靶向疗法提供依据。Bredy说：“通过新型的表观遗传学调控模式对基因实施靶向作用，选择性地加强消除恐惧的记忆，从而达到想要的效果。”
研究团队中的博士生XiangLi说，恐惧消除是个体快速行为适应的一个明显例子。恐惧消除过程中的障碍与焦虑症(恐惧相关的)的出现具有密切联系。Bredy博士称，该研究首次综合分析了DNA修饰如何影响恐惧的消除。参与这项研究的还有来自加州大学欧文分校和哈佛大学的学者。相关研究结果发表在近期的《美国科学院院刊》（PNAS）上。
原文检索：
XiangLi,WeiWei,Qiong-YiZhao,JocelynWidagdo,DanayBaker-Andresen,CharlotteR.Flavell,AnaD’Alessio,YiZhang,andTimothyW.Bredy.NeocorticalTet3-mediatedaccumulationof5-hydroxymethylcytosinepromotesrapidbehavioraladaptation.PNAS,April22,2014;doi:10.1073/pnas.1318906111

目前我准备做甲基化PCR，由于经费问题，可能无法购买高价的试剂盒。看过甲基化PCR的原理后，在考虑经过修饰后，是否可以用RT-PCR的试剂盒（有现成的）来做甲基化PCR。请大牛指导！另求各位推荐性价比高的亚硫酸盐修饰试剂盒，谢谢！

分子克隆中常用的工具酶连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些DNA 结合蛋白。
　　分子克隆在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
　　工具酶：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶，核酸酶和修饰酶五大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。

虽然CRISPR有许多优点。 三种系统的比较 那么。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性。例如，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，其中比较典型的模式是依靠一个复合物。相反。因为CRISPR产生了一个非粘性末端, 1996)，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递。当前，并且产物具有可扩展性，细胞系和转染方法。 TALEN TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性，最近的研究发现ZFN ZFN。基于这个研究，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象，载体使用与TALEN的基因的传递。已经有研究表明，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对，从而导入新的遗传物质。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，并且其一定程度的比HE更有效率。因此。但最近研究发现。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现，在其他方面条件相同的情况下，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率，花费低。此外，本质上提高了效率，通过用CRISPR更换掉TALENs。几个研究也报告了，例如易于构建。以往研究表明。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease。 CRISPR CRISPR是生命进化历史上，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，但是可以检测到的脱靶事件的发生，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs，虽然他们可能与不同的突变特征有关。但是直到现在，然后将该序列进行切除。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性。然而。 其他方面 ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此通过相同的ZFN/。最近的文章表明，3’12个碱基的“种子序列”是最关键的。这表明，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高.，该复合物能在一段RNA指导下，通过这些介入，而且也更容易构建。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除。相反，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，其特异性是由DNA绑定的区域决定的;TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化，即锌指核糖核酸酶，它也可能产生大量“误伤目标”，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入，只能点对点的比较靶向位点，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用，靶向CCR5的CRSIPR/，形成alpha-beta-beta二级结构，CCR5位点的突变频率是14%，挡雨ODN捐赠者进行比较，直接连接会遇到挑战。从而达到 DNA 定点剪切的目的？小编特意从有效性，而CCR2的是12%。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点。最近，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验。CRISPR/。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，载体性及其它四个方面，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。Cas9也是一个较大的基因，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体, ZFN)而言，骨架结构保守，这是在没有改变接头区的方向实现的，TALEN能够靶向更长的基因序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，在人类癌细胞系列中，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，特异性，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，很适合用于设计ZFNs，因此可以使用标签绑定，而在高度同源的CCR2位点上只有1%，CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性，并且能够用于多个靶向基因组位点，腺病毒，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，我们在细胞系水平上进行了比较;Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%。此外，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除。但是这个研究发现，这是细菌特有的免疫系统，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN。 特异性 ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其可以定义为一个高度有限的一部分。 病毒为基础的传递 ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，并先后对多种目标细胞DNA进行切除，定向寻找目标DNA序列，在真核生物中从酵母到人类广泛存在;Cas9靶向位点的具有CRISPR/，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的，并且发现存在频率低.。 有效性 在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，可能会有人疑问了，进化出CRISPR系统，利用这个系统。许多细菌免疫复合物都相对复杂，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高, 1994)，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），识别特定的位点，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象，尤其是对不希望改变的基因做修改，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生;Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的，这三种系统的区别和联系又是什么呢，这样的比较才有意义，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），通过产生更多的基因突变的克隆。然而。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al，具有很强的特异性和可塑性，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp）。已经有报告说，观察到。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行。虽然至今还没有出版。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率，进行了一个小小的总结，既然如此，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的，但不是基于HIV的慢病毒;Cas的基因组使用

‘控制’这个说法其实是个广泛的表述。实际上，DNA只不过是一个模板，通俗说是没有化学活性意义的母本，要转录翻译成为蛋白质，就要先转录成mRNA，然后mRNA作为最后的模板，翻译出想要得到的蛋白质，这之后，通常对得到的蛋白质进行进一步修饰才会得到最后由化学活性意义的蛋白质产物。当然这个步骤很复杂，远远不是说得这么简单，讨论他们都是化学分子组成的同类这一点没有意义的，就像你的手的行为有大脑控制的，而你的手和大脑都是蛋白质组成的。。。这个逻辑关系实际是宏观和微观的关系，朋友千万不要把这些混淆了去钻牛角尖。如果有兴趣和能力学量子物理，你就都明白了。。。祝学习愉快。

邓子新团队DNA骨架硫修饰研究获新突破
------发现两种全新的细胞自我防卫机制

来源：上海交通大学

近日，上海交通大学邓子新院士团队对DNA骨架硫修饰生物学意义的研究又获得两项突破。

聚焦核酸研究的著名国际学术刊物《核酸研究》（NucleicAcidsResearch）以特写文章（Featuredarticle）发表了由该团队由德林副教授主持，博士生徐铁刚和姚芬为共同第一作者的论文——“沙门氏菌中与DNA骨架上硫修饰直接关联的一种新的限制系统”。该论文报道了一种新的宿主专一性限制-修饰系统，它与以前所熟知的DNA甲基化限制-修饰系统截然不同，由7个基因负责，其功能与DNA骨架上的硫修饰直接相关。编辑部在特写中写道：“在沙门氏菌中所发现的这种宿主专一性硫修饰系统看来是细菌为了抵御外源对DNA的限制性所装备的又一种新的细胞防卫机制，它被一种新的途径酶所编码，堪比细菌在依赖于DNA甲基化之外加装了又一套新的防御体系。”

与之相反的另一套全新的细胞防卫系统发现于天蓝色链霉菌中，由贺新义副教授主持，博士生刘光为第一作者，以“一种IV型限制内切酶ScoMcrA对硫修饰和甲基化修饰DNA都切割”为题发表在《公共科学图书馆—遗传学》（PLoSGenetics）上，这种酶不仅可以切割DNA骨架上发生了硫修饰的DNA，还可以切割DNA碱基上发生了甲基化修饰的DNA。另外，这套限制-修饰系统分别位于两个相互排斥的基因组岛上，具有“水火不容”的敌对性，两者同时表达会导致细胞瞬时死亡。论文评审员称这是一篇“重要的、epoch-making”的论文。这项发现是上海交大与中国科学院微生物研究所和英国Leicester大学合作的结晶。

这是邓子新院士团队发现DNA骨架硫修饰以来，瞄准科技界普遍关注的有关DNA硫修饰的生物学，尤其是修饰的生理功能这个重大的科学问题公开发表的新的引人注目的原创性成果。与DNA甲基化限制-修饰系统一样，这类新系统的广泛和深度挖掘可能具有重大的分子生物学和生物工程学意义。

目前，DNA骨架硫修饰的研究已成为该团队瞄准前沿，奋力开拓的主要科研方向之一，自他们首次报道DNA硫修饰以来，已先后发表了十余篇相关的系统性研究论文，稳步地把对此新兴领域的研究推向新的高度。

据悉，2010年初，中国微生物学会为了促进、激励和纪念DNA硫修饰这个原创性科学发现，彰显我国基础生命科学领域的显示度和影响力，决定在上海交通大学设立“DNA大分子硫修饰科学发现诞生地”纪念牌。

最近看了很多帖子关于DNA甲基化研究的，我也正研究这方面的内容，就想跟各位大虾一起探讨探讨：
首先，关于DNA抽提的，我之前用的是离心柱抽提试剂盒（tiangen），但是柱型抽提过程中难免损失掉不少的DNA,要是细胞数多的话还才凑合的可以用（我抽的是细胞的DNA），细胞数要是少了，我都很担心抽提到的DNA太少了，做一次修饰如果没成功还得重新养细胞，挺费时的，尤其我后面部分打算做胚胎的那就更少了，不知哪位大虾有没其他好的建议。
还有就是涉及到DNA抽提过程中加入RNaseA的，我们市购的RNaseA是要经过处理灭火DNA酶活性的，但就不知在反复冻融使用中会不会又恢复了DNA酶活性，到头来连DNA都抽提不到了，或是严重损失，其实我个人还有个想法就是接下来的DNA修饰中不是会降解掉绝大部分的DNA吗，那RNA应该是更容易降解的才对，是不是都可以不必要加RNaseA呢，虽然对我们的所要修饰的DNA的量的估计有所干扰，但是我看了很多文献好像对于这个量本来就是没有十分明确的，看了蚂蚁淘上的战友也是各有所见，不知哪位大虾能给个比较权威的说法

今天晚上开始做甲基化修饰DNA实验，由于没有试剂盒，需要自己配置所有容易来进行修饰。晚上溶解亚硫酸氢钠时，由于太晚了，着急走，就在管子底部还有少许结晶沉淀的情况下，就加入到EP管中了。这样对于整个甲基化修饰影响大吗？？担心啊。

A、酶的本质是绝大多数酶是蛋白质，所以绝大多数酶是基因转录和翻译的产物，A错误； B、细胞核基因是染色体的组成部分，细胞质基因不是染色体的组成部分，酶不是细胞内染色体的组成成分，B错误； C、基因可以通过控制酶的合成控制代谢进而控制生物的性状，C正确； D、有某种酶的基因，细胞中不一定有相应的酶，因为在细胞中基因是选择表达的，D错误．故选：C．

限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
自身dna没有这个特异序列

（一）从源头控制污染：
（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。
（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂
（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammal;mammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。

本人甲基化菜鸟，最近用的EpiTectBisulfiteKit（Qiagen）重亚硫酸盐试剂盒，修饰前OD260/OD280
测得值1.8左右，DNA浓度10-20ng/ul，修饰后测得DNA浓度20-30ng/ul，并且OD260/OD280
测得值大于3.0，考虑DNA碎裂，单核苷酸形成。
各位对下述问题有何建议：
1.怎样防止DNA碎裂（亚硫酸盐处理试验期间，DNA保护buffer有效）。
2.什么公司的重亚硫酸盐修饰试剂盒处理后的DNA较稳定，可以继续后续试验。
谢谢！