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酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质,或一类分子结构相似的物质,促其进行一定的化学反应,产生一定的反应产物,这种选择性作用称为酶的专一性。
只不过限制性核苷酸酶是将磷酸二酯键切断;而DNA连接酶则是形成磷酸二酯键。
菌体构建时,目的基因连接在T载体上,测序也正确,但是将目的基因还有载体分别双酶切后总是连接不上,将连接后产物跑核酸胶,什么也没有,不知道是什么原因?我的目的基因浓度为9ng/ul,载体回收后的浓度为6ng/ul,是因为浓度太低的原因吗?还有就是连接有目的基因的T载体双酶切后出现了三条带,这个又是什么原因呢?希望得到解答
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix?
有没有人用过NEB的Blunt/TALigaseMasterMix和InstantSticky-endLigaseMasterMix?
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.....它说连得又快又好,想问问有木有小白鼠试过它家的这两个产品呢。。如果用过能不能请教下效果咋样呢。。我之前用Thermo的T4,属于又便宜又慢效果还可以的那类型的。。(虽然说thermo也说室温30min就ok,但是还是4度过夜了,室温30min不靠谱)
产生这一现象的原因在于 DNA合成酶只能沿5'-3'的方向合成DNA 而DNA本身的两条链又是反向分布的 所以就造成了只有一条链合成可以连续地进行下去(以它为模板的子链生成方向正好是DNA聚合酶可以直接提供的) 而后随链要盘绕成回环 反扭过来 才能合成
再合成起始的时候 DNA聚合酶是需要一段RNA引物的 在原核生物中这一引物是由dnaQ(一种酶)在已解旋的单链5'端合成,真核生物中也有对应的酶 由于后随链的合成不连续 所以每个片段都要有引物 在DNA合成结束的时候 这些引物要被切除 因而留下缺口 这时又要特定的酶去填补缺口(比如 大肠杆菌中的DNA聚合酶I)可是填补序列和周围序列间会有缺刻 也就是说他们交界处的3'-5'磷酸二脂键是断开的 这时需要DNA连接酶发挥作用 将其连好
所以 后随链上的缺刻多 还真够DNA连接酶忙一阵的 前导链上只有一开始有RNA引物 因此 最后也基本只有这个地方会用到连接酶

