OptimizedforcloningtoxicorunstableDNA
- StABIlizetoxicinsertsincommoncloningandexpressionvectors(pUCandpET-typevectors)
- Cloneandmaintainchallengingsequencesatreducedplasmidcopynumber,theninducetohighcopynumberforDNArecovery
- AvoidT1andT5phagecontaminationwithtonAmutation
- Choosechemicallycompetentcellsforgeneralcloningorelectrocompetentcellsfordemandingapplicationssuchaslibrarygeneration
Applications
- CloningofunstableDNAsequencesorthoseexpressingtoxicproteins.
CopyCutter™EPI400™E.coli*cellsweredevelopedtosignificantlylowerthecopynumberofawidevarietyofcommonvectorssothatyoucanmorereADIlycloneunstableDNAsequences.DNAthatisunstableathigh-copynumberoftencodesforaproteinthatinhibitscellgrowthorcontainsAT-andGC-richsequencesorsequenceswithstrongsecondarystructure(Fig.2).1
TheCopyCutterEPI400celllinewasderivedfromEpicentre'shigh-transformationefficiencyphageT1-resistantTransforMAX™EC100™-T1RE.colistrainbymanipulatingagenethatcontrolsthecopynumberofvectorscontainingColE1orpMB1originsofreplication(e.g.,pUC-andpET-typevectors).Thisconstitutivelyexpressedgene,pcnB(plasmidcopynumber),wasdeletedfromtheTransforMAXEC100strainandreplacedwithamodifiedpcnBgenethatislinkedtoaninducIBLepromoter,creatingtheCopyCutterEPI400strain.
ThecopynumberofColE1-typevectorsintheCopyCutterEPI400straincomparedtotheparentalTransforMAXEC100strainisapproximately4-to25-foldlower,dependingonthevector.Moreover,ashortincubationinthepresenceoftheCopyCutterInductionSolutioncanincreasethecopynumberofthevectortoimproveplasmidyields(Fig.3).
Figure1.Copy-numberofColE1-typeplasmidsisloweredupto25-foldinCopyCutter™EPI400™E.colicells.LanesC,TransforMax™EC100™cells;LanesUandI,uninducedorinducedCopyCutterEPI400cells.DNAextractsfromthesamenumberoflysedcells(basedonOD600)wereloadedperlane.
Figure2.DNAinsertsencodingtoxicgeneproductsweresuccessfullyclonedintohigh-copy-numbervectorsusingCopyCutter™EPI400™E.colicells.Aftersequencing,thefull-lengthacpPclonesinTransforMAX™EC100™cellswerefoundtocontainmultiplepointmutations. | Figure3.UninducedCopyCutter™EPI400™E.colicellscontainingaregBclone(laneU)areinducedtohigher-copynumber(laneI)usingtheCopyCutterInductionSolution.CrudeextractsofplasmidDNAwerepreparedfromcellsgrowninselectivemediaandanalyzedbyagarosegelelectrophoresis.Approximatelythesamenumberoflysedcells(basedonA600)wereloadedperlane. |
Benefits
- Maintainclonesatlow-copynumber,theninducetohighercopynumberforimprovedplasmidyield.
- Hightransformationefficiencywithclonesofallsizes.
- tonAforresistancetobacteriophagesT1andT5.
- lacZΔM15forblue/whitescreeningofrecombinants.
- Restrictionminus[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]genotypeenablesefficientcloningofmethylatedDNA.
- Endonucleaseminus(endA1)toensurehighyieldsofDNA.
- Recombinationminus(recA1)forgreaterstabilityoflargeclonedinserts.
Genotype
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGtrfAtonApcnB4dhfr
CopyCutterEPI400ElectrocompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x1010cfu/µgofpUC19.
CopyCutterEPI400ChemicallyCompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x107cfu/µgofpUC19.
Reference
- Haskins,D.(2004)EpicentreForum11(5),6.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
Tentubeseachcontaining50µLofcells(enoughcellsfor10transformations),CopyCutter™InductionSolutionandpUC19controlDNA.TheCopyCutter™InductionSolutionisprovidedata1,000Xconcentrationandisfiltersterilized.ebiomall.com
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http://www.addgene.org/crispr/guide/
客户提供:
1.目的基因信息(GenBankAccessionnumber、GeneID、或关键词)。
2.细胞系和培养条件
做黄单胞,在通过Tn5构建转化子库之后,通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后,将几个可能与致病力相关的基因做了敲除,现在正在构建互补载体,已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等,不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
缺点:质粒仍然较大,转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性,局限了基因编辑的运用范围,而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
如果觉得答案解决了你的问题,请采纳,有问题可继续追问,如未回答追问,可能是不在哦
科学家发现,细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后,可以获得其部分DNA(脱氧核糖核酸)片段并整合进基因组形成记忆,当再次遭到入侵时,转录出相应的RNA(核糖核酸),利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR/Cas9技术就是利用这一原理,用一种定制的RNA引导Cas,对预设DNA位点进行切割,造成DNA断裂,启动细胞内基因组修复机制,实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
目前,来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA(single guide RNA)。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下:
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有(汉恒生物提供cas9质粒试剂盒):
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果,但是质粒转染具有效率低,作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题,常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒,慢病毒常用质粒见addgene(lentiCRISPR v2,lentiGuide-Puro,lentiCas9-Blast),慢病毒可以整合入宿主基因组中,长期稳定的表达(汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装),但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大(大于4kb),且长期插入可能导致乱切,脱靶等,同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因,腺病毒更有优势,腺病毒克隆能力强,获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说,作用是时间也比较长,可以达到更理想的敲除效果。
基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上,自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的:首先获得小鼠ES细胞系,测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体,将打靶载体转入一定数目ES细胞中,然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,从而得到带有修饰基因的突变小鼠,而后可以对其进行表型分析。
目前,在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种,近年来随着基因敲除技术的不断进步,尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成,使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少,使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。
06年8月七日,美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组计划,目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库,研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为优秀的动物模型。展开