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OptimizedforcloningtoxicorunstableDNA
StABIlizetoxicinsertsincommoncloningandexpressionvectors(pUCandpET-typevectors)- Cloneandmaintainchallengingsequencesatreducedplasmidcopynumber,theninducetohighcopynumberforDNArecovery
- AvoidT1andT5phagecontaminationwithtonAmutation
- Choosechemicallycompetentcellsforgeneralcloningorelectrocompetentcellsfordemandingapplicationssuchaslibrarygeneration
Applications
- CloningofunstableDNAsequencesorthoseexpressingtoxicproteins.
CopyCutter™EPI400™E.coli*cellsweredevelopedtosignificantlylowerthecopynumberofawidevarietyofcommonvectorssothatyoucanmorereADIlycloneunstableDNAsequences.DNAthatisunstableathigh-copynumberoftencodesforaproteinthatinhibitscellgrowthorcontainsAT-andGC-richsequencesorsequenceswithstrongsecondarystructure(Fig.2).1
TheCopyCutterEPI400celllinewasderivedfromEpicentre'shigh-transformationefficiencyphageT1-resistantTransforMAX™EC100™-T1RE.colistrainbymanipulatingagenethatcontrolsthecopynumberofvectorscontainingColE1orpMB1originsofreplication(e.g.,pUC-andpET-typevectors).Thisconstitutivelyexpressedgene,pcnB(plasmidcopynumber),wasdeletedfromtheTransforMAXEC100strainandreplacedwithamodifiedpcnBgenethatislinkedtoaninducIBLepromoter,creatingtheCopyCutterEPI400strain.
ThecopynumberofColE1-typevectorsintheCopyCutterEPI400straincomparedtotheparentalTransforMAXEC100strainisapproximately4-to25-foldlower,dependingonthevector.Moreover,ashortincubationinthepresenceoftheCopyCutterInductionSolutioncanincreasethecopynumberofthevectortoimproveplasmidyields(Fig.3).
Figure1.Copy-numberofColE1-typeplasmidsisloweredupto25-foldinCopyCutter™EPI400™E.colicells.LanesC,TransforMax™EC100™cells;LanesUandI,uninducedorinducedCopyCutterEPI400cells.DNAextractsfromthesamenumberoflysedcells(basedonOD600)wereloadedperlane.
 |  |
| Figure2.DNAinsertsencodingtoxicgeneproductsweresuccessfullyclonedintohigh-copy-numbervectorsusingCopyCutter™EPI400™E.colicells.Aftersequencing,thefull-lengthacpPclonesinTransforMAX™EC100™cellswerefoundtocontainmultiplepointmutations. | Figure3.UninducedCopyCutter™EPI400™E.colicellscontainingaregBclone(laneU)areinducedtohigher-copynumber(laneI)usingtheCopyCutterInductionSolution.CrudeextractsofplasmidDNAwerepreparedfromcellsgrowninselectivemediaandanalyzedbyagarosegelelectrophoresis.Approximatelythesamenumberoflysedcells(basedonA600)wereloadedperlane. |
Benefits
- Maintainclonesatlow-copynumber,theninducetohighercopynumberforimprovedplasmidyield.
- Hightransformationefficiencywithclonesofallsizes.
- tonAforresistancetobacteriophagesT1andT5.
- lacZΔM15forblue/whitescreeningofrecombinants.
- Restrictionminus[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]genotypeenablesefficientcloningofmethylatedDNA.
- Endonucleaseminus(endA1)toensurehighyieldsofDNA.
- Recombinationminus(recA1)forgreaterstabilityoflargeclonedinserts.
Genotype
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsL(StrR)nupGtrfAtonApcnB4dhfr
CopyCutterEPI400ElectrocompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x1010cfu/µgofpUC19.
CopyCutterEPI400ChemicallyCompetentE.coli
- Transformationefficiencyof>1x107cfu/µgofpUC19.
Reference
- Haskins,D.(2004)EpicentreForum11(5),6.
*Coveredbyissuedand/orpendingpatents.
ORDERINFORMATION
Tentubeseachcontaining50µLofcells(enoughcellsfor10transformations),CopyCutter™InductionSolutionandpUC19controlDNA.TheCopyCutter™InductionSolutionisprovidedata1,000Xconcentrationandisfiltersterilized.蚂蚁淘电商平台
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2018-04-16
上海优予生物科技有限公司在发布的pk18mobsacB Vector,芽孢杆菌基因敲除载体供应信息，浏览与pk18mobsacB Vector,芽孢杆菌基因敲除载体相关的产品或在搜索更多与pk18mobsacB Vector,芽孢杆菌基因敲除载体相关的内容。 查看更多
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2018-07-03
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的CRISPR/Cas9 Validated CNOT7 sgRNA; 基因敲除sgRNA供应信息，浏览与CRISPR/Cas9 Validated CNOT7 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9 Validated CNOT7 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的内容。 查看更多
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2021-08-04
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的CRISPR/Cas9 Validated SLC12A9 sgRNA; 基因敲除sgRNA供应信息，浏览与CRISPR/Cas9 Validated SLC12A9 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9 Validated SLC12A9 sgRNA; 基因敲除sgRNA相关的内容。 查看更多
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2021-07-20
服务名称：Talen基因敲除小鼠 查看更多
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2021-07-26
北京强欣博瑞生物技术有限公司在发布的CRISPR/Cas9基因敲除载体 双敲，Puro抗性供应信息，浏览与CRISPR/Cas9基因敲除载体 双敲，Puro抗性相关的产品或在搜索更多与CRISPR/Cas9基因敲除载体 双敲，Puro抗性相关的内容。 查看更多
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2017-12-11
弗元生物，专注干细胞与再生医学研究，在干细胞、再生医学、基因编辑方向上竭力，为生物医学的发展做出自己的贡献。弗元生物细胞基因编辑平台与中科院合作开展CRISPR/Cas9细胞基因编辑工作，平台使用该技术编辑基因超过300例，具有丰富的实际操作经验。在非致死基因的敲除上成功率接近100%。目前，平台仅针对细胞进行操作，目标细胞包括肿瘤细胞系、永生化细胞系、原代细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS。平台采用独有的操作体系，可以快速在常规细... 查看更多
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2021-08-13
上海邦耀生物科技有限公司在发布的基因敲除大鼠供应信息，浏览与基因敲除大鼠相关的产品或在搜索更多与基因敲除大鼠相关的内容。 查看更多
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2017-08-07
上海君伯生物科技有限公司在发布的ES细胞策略构建条件性基因敲除小鼠供应信息，浏览与ES细胞策略构建条件性基因敲除小鼠相关的产品或在搜索更多与ES细胞策略构建条件性基因敲除小鼠相关的内容。 查看更多
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2021-09-06
北京高校生物技术服务平台联盟在发布的条件性基因敲除小鼠供应信息，浏览与条件性基因敲除小鼠相关的产品或在搜索更多与条件性基因敲除小鼠相关的内容。 查看更多
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博仕生物医学服务中心在发布的基因敲除小鼠（gene knock out）供应信息，浏览与基因敲除小鼠（gene knock out）相关的产品或在搜索更多与基因敲除小鼠（gene knock out）相关的内容。 查看更多
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2018-03-20
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的CDKN2A Knockout Cell Lysate; CDKN2A基因敲除细胞裂解物-CRISPR供应信息，浏览与CDKN2A Knockout Cell Lysate; CDKN2A基因敲除细胞裂解物-CRISPR相关的产品或在搜索更多与CDKN2A Knockout Cell Lysate; CDKN2A基因敲除细胞裂解物-CRISPR相关的内容。 查看更多
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基因敲除方法及其应用123
莫奈008072021-07-29
基因敲除，互补，功能研究等实验怎么做
做黄单胞，在通过Tn5构建转化子库之后，通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后，将几个可能与致病力相关的基因做了敲除，现在正在构建互补载体，已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等，不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
做黄单胞，在通过Tn5构建转化子库之后，通过致病力筛选、Tail-PCR获得侧翼序列、比对获得全基因之后，将几个可能与致病力相关的基因做了敲除，现在正在构建互补载体，已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定、胞外多糖分泌测定、生长曲线、致病性测定等等，不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的。
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（7）验证敲除WB123
维尼00942021-09-10
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
动物nrf2基因敲除后为什么还会表达123
宵夜葝蠐692021-08-09
基因敲除动物模型怎么做利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
酿酒酵母做crispr基因敲入donor dna加多少123
韩晓柒37592021-09-11
利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
Crispr/Cas9技术在CHO细胞中进行基因定点敲入的应用123
caijunlee2016-12-08
大家好，目前有没有使用crispr/cas9技术对CHO工程细胞株进行改造的（生长、代谢、表达或质量方面）
话说CRISPR技术的利与弊123
愿萌安好5311262017-10-29
优点:使用方便，构建简单，可以覆盖大多数区域的基因编辑需求，成本低。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
大肠杆菌CRISPRCas9系统基因敲除简介 123
BMW9272021-09-04
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3
类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含
有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的
DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统
只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含
有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合
成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的
DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
利用CRISPRCas9特异敲出microRNA基因家族的方法123
2楼司马笑逞鼏2021-08-10
我想理论上应该行不通吧？还是用基于同源重组的策略吧。在MicroRNA基因上或附近用CRISPR制造DSB，同时转同源重组载体来增加效率是可行的。
求助请问：有哪位高手作过小鼠基因敲除,此项技术国内是否成熟。123
2021-08-15
我自己尝试做了好几次基因敲除，效果都不好，想着干脆直接送出去算了，不知道行不行？
关于CRISPR/Cas9基因编辑技术,表述不正确的是（） 上学吧继续教...123
vhxfhggffffbjg2021-08-11
Overview of CRISPR/Cas9
http://www.addgene.org/crispr/guide/
http://www.addgene.org/crispr/guide/
crispr/cas9到底是什么东西?大家有关于这个的介绍和资料吗?123
Junny8872017-10-03
最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
CRISPRCas基因靶向修饰基因敲除基因打靶解读123
35z11701352021-08-07
课题设计； 5，而且其周期长工作量大. 获得Fo代小鼠. 体外转录sgRNA#47； 6. 获得F1代小鼠;Cas9进行活性检测，可实现多基因. 设计构建识别靶序列的sgRNA； 2； 5。虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，并获得F1阳性杂合子小鼠. 设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定; 6;； 4； 7； 3，5个月得到F1F1代杂合子小鼠;，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆： 1，速度快，得到阳性克隆;Cas9 mRNA，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定; 2。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的，用G418筛选转染后的胚胎干细胞； 3，基因敲除#47； 4，并植入到假孕小鼠的子宫内、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术. 按照课题设计. 将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中、 利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程 1;敲入效率高. 进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选. 得到嵌合鼠，最快2个月即可得到F0代阳性鼠、 基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程;Cas9 mRNA和打靶载体;，其实不然？一、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用； 8;敲入. 利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA#47，订购课题BAC菌。基于胚胎干细胞的基因打靶技术，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单将重组载体电转到胚胎干细胞中基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型. 小鼠受精卵原核注射sgRNA#47。二，在生命科学，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，完成打靶载体设计和构建。基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术、多物种基因敲除#47. 设计构建打靶载体展开
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