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Cell Technology/aCella™ TOX/500/CLATOX100
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- Description
- Additional Information
- Readable Documents
- Assay Principle
- Reviews
Key Benefits
- Safe – Non Radioactive Enzyme release assay.
- Versatile – Useful for measuring activity of T Cells, Primary Cells, NK, complement and other lytic agents.
- Assay can be run in serum supplemented media.
- Homogenous – One-step, no wash assay. Assay can be run in same plate as samples.
- FAST – Results in 3-5 minutes. Chromium 51 or europium release for measurement are time consuming. The inherent sensitivity of luciferase detection is enhanced by the amplification effect of enzyme turnover, which produces thousands, millions or billions of high – energy molecules for each molecule of the enzyme.
- Highly Sensitive – Can detect fewer than 500 cells/well in the presence of serum or as few as 10 cells/well in serum-free or heat-killed media.
- GAPDH: The fact that GAPDH is a natural component of cells, and does not need to be introduced into the cells in any manner, distinguishes this assay from all methods which require prelabelling of cells, transfection, transformation, or other methods of introducing proteins or other molecules into the target cells in order to generate a signal in a later step.
- Advantages for measurement of cell mediated or complement mediated cytolysis – It is usually desirable to use smaller numbers of TCells than are needed for the 51Cr – release assay, since excessive numbers of effector cells can increase the background signal. This is now possible due to the high sensitivity of aCella-Tox.
- ADCC / CMC Assays – A non radioactive alternative to 51Cr assays. Please click here for a direct comparison between the aCella-TOX and (51Cr) Chromium Release Methods
- HTS – Adaptable for High Throughput format
- Non-destructive assay allows monitoring of additional parameters.
Additional information
| Kit Size | 500, 1000 |
|---|---|
| Includes | No Plates, 5 Lumi Plates, 5 Lumi Plates + 5 Tissue Culture Plates |
GAPDH is an important enzyme in the glycolysis and gluconeogenesis pathways. This homotetrameric enzyme catalyzes the oxidative phosphorylation of D-glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-diphosphoglycerate in the presence of cofactor and inorganic phosphate. In the aCella-TOX reaction scheme the release of GAPDH is coupled to the activity of the enzyme 3-Phosphoglyceric Phosphokinase (PGK) to produce ATP. ATP is detected via the luciferase, luciferin Bioluminescence methodology. Further, aCella-TOX is a homogeneous cytotoxicity assay; alternatively in dual mode, aCella-TOX can measure cytotoxicity and cell viability in the same plate. Culture supernatants can also be removed from the original plate and assayed in a different plate, allowing kinetics runs to be set up. The assay is non-destructive, allowing the monitoring of additional parameters such as gene expression.
| Document Title |
| aCella-TOX v1_3 Protocol |
| aCella-TOX Datasheet |
| msds.aCella-TOX |
| Title | File | Link | Author(s) | Journal | Year; Edition:Pages |
| Heat shock enhances the expression of cytotoxic granule proteins and augments the activities of tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3468674/ | Takahashi A, Torigoe T, Tamura Y, et al. | Cell Stress & Chaperones | 2012;17(6):757-763 | |
| IGF-1R peptide vaccines/mimics inhibit the growth of BxPC3 and JIMT-1 cancer cells and exhibit synergistic antitumor effects with HER-1 and HER-2 peptides. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4368154/ | Foy KC, Miller MJ, Overholser J, Donnelly SM, Nahta R, Kaumaya PT | Oncoimmunology | 2014;3(11):e956005 | |
| HER-3 peptide vaccines/mimics: Combined therapy with IGF-1R, HER-2, and HER-1 peptides induces synergistic antitumor effects against breast and pancreatic cancer cells. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4368151/ | Miller MJ, Foy KC, Overholser JP, Nahta R, Kaumaya PT | Oncoimmunology | 2014;3(11):e956012 | |
| Phase I Active Immunotherapy With Combination of Two Chimeric, Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, B-Cell Epitopes Fused to a Promiscuous T-Cell Epitope in Patients With Metastatic and/or Recurrent Solid Tumors. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2773479/ | Kaumaya PTP, Foy KC, Garrett J, et al. | Journal of Clinical Oncology | 2009;27(31):5270-5277 | |
| Identification of Cellular Proteins Required for Replication of Human Immunodeficiency Virus Type 1. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448097/ | Dziuba N, Ferguson MR, O"Brien WA, et al. | AIDS Research and Human Retroviruses | 2012;28(10):1329-1339 | |
| Insulin-Like Growth Factor-1 Receptor Signaling Increases the Invasive Potential of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Overexpressing Breast Cancer Cells via Src-Focal Adhesion Kinase and Forkhead Box Protein M1. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4293451/ | Sanabria-Figueroa E, Donnelly SM, Foy KC, et al. | Pharmacology | 2015;87(2):150-161 | |
| Combination Treatment with HER-2 and VEGF Peptide Mimics Induces Potent Anti-tumor and Anti-angiogenic Responses in Vitro and in Vivo. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3075707/ | Foy KC, Liu Z, Phillips G, Miller M, Kaumaya PTP | The Journal of Biological Chemistry | 2011;286(15):13626-13637 | |
| Resistance to Cytarabine Induces the Up-regulation of NKG2D Ligands and Enhances Natural Killer Cell Lysis of Leukemic Cells. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2586691/ | Ogbomo H, Michaelis M, Klassert D, Doerr HW, Cinatl J. | Neoplasia (New York, NY) | 2008;10(12):1402-1410 | |
| Anti-Tumor Effects of Peptide Therapeutic and Peptide Vaccine Antibody Co-targeting HER-1 and HER-2 in Esophageal Cancer (EC) and HER-1 and IGF-1R in Triple-Negative Breast Cancer (TNBC). | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4586465/ | Overholser J, Ambegaokar KH, Eze SM, et al. | Disis ML (Nora), ed. Vaccines | 2015;3(3):519-543 | |
| Generation and preclinical characterization of an antibody specific for SEMA4D. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4966508/ | Fisher TL, Reilly CA, Winter LA, et al. | mAbs | 2016;8(1):150-162 | |
| A Human Anti-M2 Antibody Mediates Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) and Cytokine Secretion by Resting and Cytokine-Preactivated Natural Killer (NK) Cells. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4411161/ | Simhadri VR, Dimitrova M, Mariano JL, et al. | Reeves RK, ed. PLoS ONE | 2015;10(4):e0124677 | |
| Natural Cytotoxicity Receptor-Dependent Natural Killer Cytolytic activity Directed at Hepatitis C Virus (HCV) Is Associated With Liver Inflammation, African American Race, IL28B Genotype, and Response to Pegylated Interferon/Ribavirin Therapy in Chronic HCV Infection. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3997579/ | Meng Q, Rani MRS, Sugalski JM, et al. | The Journal of Infectious Diseases | 2014;209(10):1591-1601 | |
| Myxoma Virus Infection Promotes NK Lysis of Malignant Gliomas In Vitro and In Vivo. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3677932/ | Ogbomo H, Zemp FJ, Lun X, et al. | Ulasov I, ed. PLoS ONE | 2013;8(6):e66825 | |
| Targeting a Glioblastoma Cancer Stem Cell Population Defined by EGF Receptor Variant III. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5661963/ | Emlet DR, Gupta P, Holgado-Madruga M, et al. | Cancer research | 2014;74(4):1238-1249 | |
| Genetically Associated CD16+56− Natural Killer Cell Interferon (IFN)-αR Expression Regulates Signaling and Is Implicated in IFN-α-Induced Hepatitis C Virus Decline. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3295604/ | Conry SJ, Meng Q, Hardy G, et al. | The Journal of Infectious Diseases | 2012;205(7):1131-1141 |
| Reference |
| Methods and compositions for coupled luminescent assays. United States Patent 6,811,990 Corey and Kinders, issued November 2, 2004. |
| Corey, M. J. and Kinders, R. J. (2005) "Coupled Luminescent Methods in Drug Discovery: 3-Min Assays for Cytotoxicity and Phosphatase Activity" Drug Discovery Handbook, Ed. Shayne Cox Gad, published by John Wiley & Sons, Inc., pp. 689-731 |
| Corey, M.J., et al., "A Very Sensitive Coupled Luminescent Assay for Cytoxicity and Complement-Mediated Lysis," Journal of Immunological Methods 207:43-51, 1997. |
| Corey, M. J., et al., Mechanistic Studies of the Effects of Anti-factor H Antibodies on Complement-mediated Lysis,” Journal of Biological Chemistry 275: 12917-12925, 2000. |
| Schafer, H., et al., "A Highly Sensitive Cytotoxicity Assay Based on the Release of Reporter Enzymes, From Stably Transfected Cell Lines," Journal of Immunological Methods 204:89-98, 1997. |
| Racher, LDH Assay, in Cell and tissue culture: Laboratory procedures in biotechnology, A. Doyle and J.B. Griffiths, Eds. 1998, John Wiley & Sons: Chichester, New York, Weinheim. p. 71-5 |
| Decker, T. and Lohmann-Matthes, M.L. (1988) A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. J. Immunol. Meth. 115, 61-9. |
| Korzeniewski, C. and Callewaert, D.M. (1983) An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J. Immunol. Meth.64, 313-20. |
| Crouch, S.P.M., et al., "The Use of ATP Bioluminescence as a Measure of Cell Proliferation and Cytotoxicity," Journal of Immunological Methods 160:81-88, 1993. |
| Henry Ogbomo, Anke Hahn, Janina Geiler, Martin Michaelis, Hans Wilhelm Doerr, Jindrich Cinatl Jr. NK sensitivity of Neuroblastoma cells determined by a highly sensitive coupled luminescent method;Biochemical and Biophysical Research Comunications 339 (2006) pp375-379. Click here to read the publication |
| Part# | Reagent | Temperature |
| Part # 6001 | 4X Enzyme Assay Reagent | -20C |
| Part # 3008 | 1X Enzyme Assay Diluent | 2-8C |
| Part # 6003 | Glyeraldehyde 3-Phosphate (G3P) | -20C |
| Part # 6002 | 50X Detection Reagent | -20C |
| Part # 3009 | 5.5X Detection Assay Diluent | -20C |
| Part # 3035 | Lytic Agent | 2-8C |
| N/A | 5 Lumi Plates (Catalog# CLATOX100-3L) | N/A |
| N/A | 5 Lumi Plates + 5 Tissue Culture Plates (Catalog# CLATOX100-3P) | N/A |
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
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2021-09-08
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与POGK Knockout HeLa Cell Line; POGK 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-09-15
2017 年 4 月，维通达自主研发的基因修饰明星小鼠模型 NPG 小鼠，荣登国际著名学术期刊《Cell》，人源化 NPG 荣登《Molecular Therapy》。为此，维通达特推出【大小鼠基因敲除服务 买一赠一活动】。我们用更便捷、更专业、更优质的动物模型，助您成就科研梦想。活动时间：2017 年 6 月 1 日～2017 年 8 月 31 日活动内容：基因敲除小鼠 49800（买一赠一） 立即购买 >> 1.最快... 查看更多
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2021-08-01
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与IDS Knockout HeLa Cell Line; IDS 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-08-18
随着分子生物学技术和生物信息学的发展，功能基因组学的研究已成为基因组学中引人注目的新方向和研究热点。利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。「智能信息处理技术」为人力资源与社会保障部中国科学院北京分院国家级专业技术人 查看更多
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2021-08-20
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的VASP Knockout Cell Lysate; VASP基因敲除细胞裂解物-CRISPR供应信息，浏览与VASP Knockout Cell Lysate; VASP基因敲除细胞裂解物-CRISPR相关的产品或在搜索更多与VASP Knockout Cell Lysate; VASP基因敲除细胞裂解物-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-07-21
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与EGFR Knockout HeLa Cell Line; EGFR 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-08-22
百奥迈科生物技术有限公司在发布的Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除技术）供应信息，浏览与Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除技术）相关的产品或在搜索更多与Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay （CRISPR/Cas9 基因敲除 查看更多
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2021-09-09
博雅辑因（北京）生物科技有限公司在发布的FGFR4 Knockout HeLa Cell Line; FGFR4 基因敲除细胞-CRISPR供应信息，浏览与FGFR4 Knockout HeLa Cell Line; FGFR4 基因敲除细胞-CRISPR相关的产品或在搜索更多与FGFR4 Knockout HeLa Cell Line; FGFR4 基因敲除细胞-CRISPR相关的内容。 查看更多
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2021-09-18
动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。近几年来，制备动物模型的基因敲除技术主要包括传统ES基因打靶、TALEN、CRISPR/Cas9， 近期又有一项新的基因敲除技术——TetraOne... 查看更多
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2018-06-02
基因敲除 基因敲除(knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以... 查看更多
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2021-09-10
服务名称：TALEN基因敲除大鼠定制 查看更多
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2017-10-12
上海邦耀生物科技有限公司在发布的TALEN技术制备基因敲除大鼠供应信息，浏览与TALEN技术制备基因敲除大鼠相关的产品或在搜索更多与TALEN技术制备基因敲除大鼠相关的内容。 查看更多
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为什么基因敲除会导致基因表达量下降 123
上好佳鲜虾片诶2021-08-05
基因敲除为什么会导致表达量的下降原因是什么？
尽量简洁
尽量简洁
CRISPRCas9基因敲除实验步骤 day 25？ 正式实验123
血刺_裁决1732017-10-29
通过删除或者添加个别碱基，从而破坏基因的编码区，达到敲除的目的。常见的是由于个别碱基的增加或缺失而引起移码突变。
CRISPRCas9技术原理123
无风642021-07-28
CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。
CRISPR derived RNA
就是用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统衍生的RNA。
CRISPR derived RNA
就是用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统衍生的RNA。
CRISPR/Cas9 系统目前的研究热点有哪些方面?123
TASG13072017-10-02
1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：
构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：
严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：
基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：
构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：
严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：
基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除
crispr/cas9到底是什么东西?大家有关于这个的介绍和资料吗?123
Junny8872017-10-03
最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
基因敲除小鼠 123
阿豪系列2552021-08-26
指利用同源重组技术，将目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或功能域用一段外源DNA序列替代，获得在整个发育时期（从1细胞胚胎期到成年期）的全身所有组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。2.优缺点：优点：打靶策略的设计及打靶载体构建简单；缺点：目的基因的敲除可能引起胚胎致死或导致其他基因的表达失调。如果预测存在这种风险，可以使用条件性基因敲除设计策略。3.原理：常规基因敲除策略是以筛选基因新霉素（Neo）取代目的基因的一个或多个外显子来实现目的基因的敲除。该基因敲除发生在全身所有的细胞及组织中，可能存在胚胎致死风险，条件性基因敲除策略能够规避这一风险。
CRISPRCas基因靶向修饰基因敲除基因打靶解读123
35z11701352021-08-07
课题设计； 5，而且其周期长工作量大. 获得Fo代小鼠. 体外转录sgRNA#47； 6. 获得F1代小鼠;Cas9进行活性检测，可实现多基因. 设计构建识别靶序列的sgRNA； 2； 5。虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，并获得F1阳性杂合子小鼠. 设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定; 6;； 4； 7； 3，5个月得到F1F1代杂合子小鼠;，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆： 1，速度快，得到阳性克隆;Cas9 mRNA，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定; 2。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的，用G418筛选转染后的胚胎干细胞； 3，基因敲除#47； 4，并植入到假孕小鼠的子宫内、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术. 按照课题设计. 将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中、 利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程 1;敲入效率高. 进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选. 得到嵌合鼠，最快2个月即可得到F0代阳性鼠、 基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程;Cas9 mRNA和打靶载体;，其实不然？一、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用； 8;敲入. 利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA#47，订购课题BAC菌。基于胚胎干细胞的基因打靶技术，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单将重组载体电转到胚胎干细胞中基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型. 小鼠受精卵原核注射sgRNA#47。二，在生命科学，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，完成打靶载体设计和构建。基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术、多物种基因敲除#47. 设计构建打靶载体展开
【原创】CRISPR/Cas9 Talen基因敲除技术交流_问答详情_CRISPR基...123
晴天20142021-09-13
大家好，对于新技术CRISPR/Cas9Talen-基因敲除，这里有一个群，331527578，群里有一些资料，欢迎大家进群学习、交流331527578331527578
转基因和基因敲除技术介绍 123
2021-07-27
转基因动物(Transgenic animal) 指基因组中整合有外源基因, 并能表达和遗传的一类动物。转基因体系打破了自然情况下的种系隔离, 使基因能在种系遥远的机体间流动, 既可加快家畜品种的改良力度, 提高畜产品品质, 又可生产珍稀药用蛋白.
基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理，通过将设计好的打靶载体导入细胞后，同源臂发生同源重组，从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变，获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出：基因敲入即引入新的基因或突变；基因敲出即使某个特定的基因得到破坏，可以用于研究基因的功能。
基因敲除指利用染色体间基因打靶的原理，通过将设计好的打靶载体导入细胞后，同源臂发生同源重组，从而在基因组的某个特定位点引入预定的突变，获得基因型发生了改变的动物。可以分为基因敲入和基因敲出：基因敲入即引入新的基因或突变；基因敲出即使某个特定的基因得到破坏，可以用于研究基因的功能。
CRISPR基因编辑技术又取得了哪些爆发式进展?123
无节操hyC2021-09-02
中山大学人类胚胎遗传性致病基因修复实验采取了CRISPR／Cas9基因编辑技术。该技术是近年在锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术之后出现的新型基因编辑技术，原理来自细菌的适应性免疫防御机制。相比传统的基因打靶技术和其他基因编辑技术，CRISPR／Cas9更为精确、高效和经济。
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。
话说CRISPR技术的利与弊123
愿萌安好5311262017-10-29
优点:使用方便，构建简单，可以覆盖大多数区域的基因编辑需求，成本低。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
缺点：质粒仍然较大，转染难度相对较大。具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。
crisprcas9精细原理:基因敲除、点突变、基因插入讲解学习_...123
黑葱TA00012021-07-25
十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。
近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。
如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。
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