Description:
ThecatalyticsubunitofcAMP-dependentProteinKinase(PKA)isaserine/threonineproteinkinase,whichcombines,intheabsenceofcAMP,withtheregulatorysubunittoformtheinactivePKAholoenzyme.Sincethisisthefreecatalyticsubunitalone,nocAMPisrequiredforactivation(1,2).Whenpurifiedfrommammaliantissue,thePKAcatalyticsubunitisalwaysphosphorylatedatT197,essentialforcatalysis.MostlikelyaheterologouskinaseisresponsIBLeforthisinvivophosphorylationofPKA.AlthoughthefullyactivePKAexpressedinE.coliautophosphorylatesonbothT197andS338,thisdoesnotreflectthemechanismusedineukaryoticcells(3).
ProductSource
IsolatedfromastrainofE.colithatcarriesacloneexpressingthemurinePKAcatalyticsubunit(αisoform)undercontrolofaT7expressionsystem(2,3)(CDNAkindlyprovidedbyDr.G.S.McKnight).RecognitionDeterminant
TherecognitionmotifforphosphorylationbyPKAisRRXS/TY,whereYtendstobeahydrophobicresidue.APheinthenearbysequencetendstobeanegativedeterminantforphosphorylationbyPKA.Somevariationswithregardtospacingandbasicresiduesarepermissible(2,4).ReagentsSupplied
Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:
| Storeat(°C) | Concentration | |
| NEBuffer™forProteinKinases(PK) | -20 | 10X |
Notes:
Optimalincubationtimesandenzymeconcentrationsmustbedeterminedempiricallyforeachparticularsubstrate.Ifpossible,theATPconcentrationshouldbeatornearsaturation(5-10-foldoverKm).ApparentKmvaluesofATPformostproteinkinasesarebelow100μM.However,iftheobjectiveistomeasureenzymeactivityusinggamma-labeledATP,itisbesttouse100-200μMATPinordertohavehigherspecificactivityofgamma-labeledATP(100-500cpm/pmol).Also,anexcessofsubstrateshouldbeused,andthelevelofphosphorylationshouldnotexceed10%fordeterminationoftheinitialrate.Tophosphorylateaproteinorpeptidesubstratetocompletion,theATPconcentrationshouldbeabout5-foldoverthelimitedsubstrateconcentration.Higherenzymeconcentrationandprolongedincubationtimesshouldbeemployed.Recommendedreference:ProteinPhosphorylation:APracticalApproach(1993)ed.Hardie,D.G.IRLPress.ThisclonehasanucleotidesequenceidenticaltotheGenBankentryNM_008854,asenteredbyDr.G.S.McKnight.Ifthesourceofproteintobephosphorylatedisacrudeextractofcellsortissue,itisveryimportanttoincludetheappropriateproteaseandproteinphosphataseinhibitorsinthelysisbufferandtouseshorterincubationtimeforphosphorylation.ebiomall.com
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胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种,EC 3.4.4.4,是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中,作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌,受肠激酶,或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶,是肽链内切酶,它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用,而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体,起活化作用。是特异性最强的蛋白酶,在决定蛋白质的氨基酸排列中,它成为不可缺少的工具。
(2)不同点:①影响因素:变构调节是由细胞内变构效应剂浓度的改变而影响酶的活性;化学修饰调节是激素等信息分子通过酶的作用而引起共价修饰。②酶分子改变:变构效应剂通过非共价键与酶的调节亚基或调节部位可逆结合,引起酶分子构像改变,常表现为变构酶亚基的聚合或解聚;化学修饰调节是酶蛋白的某些基团在其他酶的催化下发生共价修饰而改变酶活性。③特点及生理意义:变构调节的动力学特征为S型曲线,在反馈调节中可防止产物堆积和能源的浪费;化学修饰调节耗能少,作用快,有放大效应,是经济有效的调节方式。
炎性体(inflammasome)是细胞内的一类多蛋白复合物,在炎性反应中发挥着至关重要的作用。炎性体包括半胱天冬酶-1(caspase1)、PYCARD和NALP,有时也包括半胱天冬酶-5(caspase5,也被称作半胱天冬酶-11或ICH-3)。它是在骨髓细胞(myeloidcell)中产生的,也是先天性免疫系统的一个组分。炎性体的确切组成依赖于启动炎性体组装的激活物,如双链RNA和石棉会引发不同的炎性体组成。炎性体促进炎性细胞因子IL-1β和IL-18成熟。
在一项新的研究中,来自比利时法兰德斯生物技术中心/根特大学(VIB/UGent)的LieselotteVandeWalle博士、DanielJiménezFernández以及教授MoLamkanfi研究团队对半胱天冬酶-12(caspase12)的功能产生新的认识。基于此,他们打破了这个领域对半胱天冬酶-12的固执观念:半胱天冬酶-12是炎性体的负调节物。这些新的认识为研究人员挣脱现有的研究路线和鉴定它的真正生理学功能铺平道路。相关研究结果发表在2016年6月2日那期Nature期刊上,论文标题为“Doescaspase-12suppressinflammasomeactivation?”。
研究人员也指出这将需要进行大量的“重新研究(re-researching)”。之前所谓的半胱天冬酶-12在细胞死亡、应激反应、疟疾和败血症等中的作用---引用了9000多次---必需复核,这是因为这些作用经常是基于不正确的小鼠模型得出的。
VIB/UGent教授MoLamkanfi说,“我们发现在很多情形下,对半胱天冬酶-12的研究是基于对半胱天冬酶-11(caspase11)和半胱天冬酶-12都进行基因敲除的小鼠模型开展的。因此从研究结果中推断半胱天冬酶-12的作用是不可能的。我们如今引入新的选择性半胱天冬酶-12基因敲除小鼠,这应当能够让我们追踪半胱天冬酶-12的确切功能。”
利用这些新的小鼠,Lamkanfi团队证实在体外模拟的BMDM(bonemarrow-derivedmacrophage,骨髓衍生性巨噬细胞)和体内接种的小鼠中,半胱天冬酶-12缺乏都不能增加半胱天冬酶-1激活。剔除半胱天冬酶-12也不会增强炎性体途径释放出成熟的IL-1β和IL-18。他们的发现表明不论半胱天冬酶-11的表达状态如何,半胱天冬酶-12都不会作为半胱天冬酶-1激活的生理学上负显性调节物,因而也不会作为炎性体的生理学上负显性调节物。
你这里应该是单指蛋白质水解酶。事实上,细胞内所有的蛋白水解酶发挥作用都需要一定的条件,并且一般都是有特异性的。有的是序列的特异性,有的是构象的特异性。
大多数的蛋白酶都不会降解自身,因为自身不含蛋白酶的酶切位点。
当然也有特例,最常见的是自身催化酶解。
举个例子,细胞凋亡中起始型的Caspase,例如Caspase-1,在有外界刺激(例如炎症小体存在)的情况下,会自身催化,把自己切割成三个片段,其中的两个片段组合成为四聚体,在下游发挥作用。
其他能够自剪切的酶还有很多,很多酶的成熟都需要外界刺激诱发蛋白酶原的自剪切。例如胰蛋白酶、弗林蛋白酶等。
当然发生这所有的催化反应都是需要特定的条件的。
还有一类就是像胃蛋白酶一类的特异性较差的消化道蛋白酶,其实是可以降解自身的。只是需要在pH很低的情况下,这时候,往往食物来源的蛋白质含量很高,多数蛋白酶用于消化食物,少部分会降解自身(极极少量)。胃持续分泌蛋白酶,因而胃蛋白酶有损失也影响不大。

