日本上市公司NewJapanChemical(44060)20162020年二季度财务报表数据...
试剂、试剂盒 | 乙醇双蒸水DNA模板[a-32P]ATP 仪器、耗材 | RT-PCR竞争子构建试剂盒
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 乙醇 去除RNA酶的双蒸水 2.核酸和寡核苷酸 DNA模板(0.5~1.0ug线性化的质粒模板或0.1~0.5ugPCR模板) 3.放射性复合物 [a-32P]ATP(10mCi/ml)(lCi=37GBq) 4.实验器材 RT-PCR竞争子构建试剂盒(Ambion;包括T7RNA聚合酶、10倍的转录缓冲液、5倍的NTP溶液、MnCl2、DNA酶I、凝胶上样缓冲液、探针洗脱缓冲液) 二、方法 1.室温下准备转录反应,按下列顺序添加试剂。 10倍的转录缓冲液 2ul 5倍的NTP溶液 4ul DNA模板 1~5ul [a-32P]ATP(10MCi/ml) 0.4ul T7RNA聚合酶 2ul 2.轻弹管子混匀试剂,简单离心,收集反应混合物于管底。 3.37°C孵育转录反应2~4h。 4.从每种样品中取出1ul,用于以后的竞争子浓度测定。 5.在转录反应混合物中加入40ul探针洗脱缓冲液和200ul乙醇。 6.-80°C孵育20min。 7.4°C最大转速离心,沉淀转录反应产物。 8.吸走上清液,用70%的乙醇清洗沉淀并在空气中干燥沉淀。 9.用16ul去除RNA酶的双蒸水溶解沉淀。 10.95°C热变性重悬的沉淀(其中含有DNA模板和被转录的RNA)2min。 11.加入2ul10倍的转录缓冲液和2ul去除RNA酶的DNA酶I(5U/ul)。 12.轻弹管子混合反应试剂,离心,收集反应混合物于管底。 13.37°C孵育lh。 竞争子的纯化 14.添加22ul凝胶上样缓冲液Ⅱ到DNA酶I的反应中。 15.95°C对样品进行变性3min。 16.在变性聚丙烯酰胺(6%丙烯酰胺/8mol/L尿素)凝胶上跑样,直到溴酚蓝达到凝肢底部。 17.从凝胶上去掉一个玻璃板,用塑料膜覆盖凝胶,放上X射线片放射自显彩30min~2h。 18.显影X射线片并对齐放在凝肢的下面,用解剖刀或剃刀刀片从凝胶上切下全长RNA转录本。 19.转移凝肢碎块到小离心管中。加300ul探针洗脱缓冲液,通过简单离心浸没碎块。 20.37°C孵育过夜。 21.扔掉管中的丙烯酰胺凝胶碎块,加入600ul乙醇包含RNA转录本的探针洗脱缓冲液。 22.-80°C孵育20min。 23.4°C最大转速离心15~20min。 24.用70%乙醇洗涤沉淀,空气中干燥。 25.用15ul去除RNA酶的双蒸水溶解沉淀。 竞争子RNA定量 26.转移1ul转录反应物和1ul纯化的竞争子RNA到闪烁管中,加入闪烁液,闪烁记数。 27.使用记数结果,用下面的公式计算出竞争子的浓度(umol/ul或拷贝/ul)。 竞争子RNA(umol/L)=(1ul纯化的竞争子RNA的cpm÷1ul转录反应物的cpm)X(竞争子RNA中的500umol/LATP/A的总量) 竞争子RNA(拷贝/ul)=(1ul纯化的竞争子RNA的cpm÷lul转录反应物的cpm)X(1ul竞争子RNA中3X1014ATP分子/A的总量) 28.竞争子应以不小于6X1010拷贝/ul或0.1umol/L的浓度储存在-20°C条件下,保期可达1年。 免责声明 本文仅代表作者个人观点,与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺,请读者仅作参考,并请自行核实相关内容。
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发布于 : 2018-08-06
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