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一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下:
对照组基因A的CT值为20, 内参(比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18,内参CT值14。
首先算加样量:delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍,所以4处以2=2,最后的相对量是2倍。
几点注意:
1。必须确定扩增的特异性
2。 只有相同目标的CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。 2的某次方只是理论值,实际扩增效率低于2。
4。 最好不用Syber Green
另外还有几个问题。就是跑出来的结果RFU居然有负值,这是怎么回事呢?几乎在0附近,但是在溶解曲线求导前的那个曲线。RFU又是从2400+开始下降的,这是为什么呢?
还需要反转录用的引物、定量PCR用的一对引物、荧光信号源(荧光染料或荧光标记的探针,看你用什么策略来做定量PCR)
报价要看你需要服务商提供什么服务,如果你只提供实验材料,要求服务商做以上全部工作,只检测一个指标(一个基因的表达水平变化),价格大约每个样品350-500元,多一个指标大约多90元。
一般至少做一组数据两个样品嘛,所以你按1000块一组样品预算吧。
这样设想的前提是因为,普通Taq酶也具有5‘-3’外切酶活性,如果可以的话,与普通PCR相比,反应体系需要做什么样的改动呢?
用的是ABI的机器。
半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
定量RT-PCR(quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR)是在用一步法或两步法,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR需要跑电泳,根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低,而定量RT-PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低。
在另外的一组管子中,加入已知拷贝数的DNA同时扩增,每个管子中加入的数量是不同的,但是从最小数目到最大数目的这个范围涵盖了样本中DNA拷贝数。
PCR反应完成后,把已知拷贝数DNA的量和PCR荧光Ct值制成标准曲线,再把待测样本的CT值和该标准曲线比对,就可以得到样本中的起始拷贝数了
C代表的是cycle,循环数目,T代表的是threshold,阈值。
所以表达量越少的话,需要越多的循环才能扩增出来。也就是CT值越高



