
CloneAmp HiFi PCR Premix is designed for use with the In-Fusion Cloning system due to its exceptionally accurate and efficient DNA amplification. The 2X master mix contains enzyme, optimized buffer, and dNTPs, allowing rapid setup of PCR reactions and facilitating high-throughput applications for multiple cloning samples.
ebiomall.com
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
>
1)PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.用boosterPCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在107~108.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平
2)退火温度是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整.有条件的可以做grADIentpcr.退火的时间在30-60S,时间短一些可以得到更好的效果.
3)首先是你的TAQ酶要在冰上操作,以免失活(Taq酶容易失活所以冬天最容易出结果),TAQ酶使用时最好分装。再就是你的引物以及DNTP和模板操作完后一定放进冰箱,注意不要污染,PCR完成后要及时从PCR仪取出(如果你的PCR仪没有保温功能),如果你放在外面时间较长可以放-20度冰箱(尤其片段比较小时)。TAQ酶一般比较稳定,按照一般的惯例,分子生物学的东西从转运到加样,全部要在冰上操作
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.
一些高保真没的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外,一般的情况下,变性的温度可以使用90~92度,变性的时间也可以缩短,
4)Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性,一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度
PCR实验中出现的问题及对策:
一、非特异性条带
原因:1>引物特异性差2>模板、引物↑;3>酶过量;4>Mg离子浓度↑;5>Tm↓;6>循环次数太多;7>被基因组DNA污染
对策:1>重设引物;2>引物、模板↓;3>减少酶量;4>Mg浓度;5>Tm适当;6>减少循环次数7>重新处理样品
具体措施:
1、Primer浓度过高,建议以0.1uM间隔递减
2、酶量过多,建议0.5U间隔递减
3、循环次数过多,建议2个循环间隔递减
4、Anneal温度过低,以1度间隔递增。不迷信文献上所谓的退火温度。摸下梯度,范围应该是Tm-10和Tm+5。一般选Tm值低5度的温度开始摸条件,很难摸出时可以使用降落PCR,普通的9600PCR仪也可以做,只是程序麻烦些。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
5、采用Hotstart法或Coolstart法,减少从室温上升到变性温度过程中引起的Primer非特异性Annealing。简易热启动的方法是加样时最好在冰上加,当然可以做个简易冰盒,直接在94度放入样本到机器,效果不错。
6、Template量过多,Template量以20%递减。PCR模板是关键,引物可以优化。制备模板的时候,一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入,同时还要注意添加模板的量,模板很理想的话,不用加太多,加的多了,混进去的杂质机会就多了。
7、Extension时间过短,30s间隔递增。
二、带微弱
1.出现的现象:扩增带时有时无,出现时与国外文献中的照片相似,不出现是则看不到或者非常弱。
2.曾用的解决方法:换过PCR中所用的试剂。甚至想到引物之间可能有二聚体等影响结果(虽然文献中及自己的实验中有时能出现很好的结果,但实在是万般无奈),把各引物单独或者两两结合进行试验,时好是坏。
3.思考:第一点,是否是管子的问题?管子的质量不是很好(为了便宜),特别是外形不是很规矩,与扩增仪上的管孔结合不紧密,又不经常加油,而原装管子则与管孔结合较紧密。是否由于此而使管内温度与实际设定温度不符呢?第二点,那么是否是变性温度较高使酶过早的失活?虽然扩增的产物很弱,但分子量是相符的,说明扩增在进行,只是产物量较少,这可能与Taq酶的活性有关.
4.最后解决:将变性温度由文献的95℃改为94℃,问题解决。以后各次扩增均得到满意的结果。
三、设立对照
设立阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用重新处理样品。
设立阳性对照可以检测是否模板CDNA及引物有问题。
空白对照:加的是“水”——出现“区带”
待检样品:加的是“模板”——无“带”
说明:1,水被污染
2,模板阴性
四、遇到意外继续实验
PCR体系遇到停电就放在4度1天,还可以扩出来,意外时不要扔还可以做一次啊
PCR操作注意点
1、写好试剂标签
1)对于需要存放的试剂、样品,都有明确的标签,套小的密实袋,离心管上有品名、浓度、日期,在密实袋上会重复写一次;
2)实验记录上还会记下新来试剂的存放日期;
3)用成品试剂盒时,除了会在实验记录上记下某日用量多少,还会在试剂盒盖内侧标明某日用量。
2、管子放置
做大批量PCR用八连管,八连管的盖子有一端有缺口,有缺口的那段向着自己,有时碰到盖好后没有拿稳掉下来,也能准确无误的分清楚前后次序。
3、准备工作
实验之前,试剂器皿仪器都准备妥当,且在脑海中将实验目的和步骤联系起来再进行一遍对比检查,确认无误后,就快速准确的动手实验。
1)酶和dNTP最好分装.
dNTP的质量与浓度: dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
2)PCR前,将枪等物品放在超净台中,用紫外照射半小时,可以破坏DNA,防止气溶胶污染等。但是,PCR不一定非要在超净台进行,如做质粒PCR就不那么严格.
3)PCR时,试剂化冻后,都稍稍振荡(手弹或者颠倒混匀),离心后再取(通常几秒钟,当转速到2000转左右关离心机)。(1)较均匀;(2)盖上沾的试剂被离下,不浪费试剂和减少污染。质粒DNA在取用之前,混匀的时间要稍长些。
4)PCR反应体系需要在冰上进行配制,以免酶失活或者核酸降解,反应用的器皿和微量离心管都需要进行严格的灭菌。
5),两个引物可以加在一起分装或单独分装都可以.
4、预热PCR仪
上样前,预热PCR仪,对于PFU酶比较关键,先设置好PCR的程序然后再去配体系,别配好体系才想起PCR仪还没开。
5、加样:
1》、加样顺序
1)按照buffer-dNTP-引物-模板-Taq酶-水这个顺序加,不易起泡.
2)或加样顺序倒没有特别要求,只是Taq酶要注意最后加,加完就放到冰箱里或通常在冰箱里面加酶。然后按体积从大到小地一一加入.
3)或珍贵的、易引起污染的物质先加。
比如1、如果样品DNA很稀少,很宝贵,避免DNA间的污染就要首先考虑:第一步先加水,第二步就紧接着加DNA,这样加相同DNA就可以不换TIPS,又不会在DNA中污染引物等其他东西。
比如2、如果用随机引物,缓冲体系和酶就要重点保护???,先加它们再加引物和模板。
比如3、如果用的酶有外切活性,如PyroBest,pfu,就必需把酶放到最后加,否则他们有可能把引物都折磨得面目全非。
2》、混合加样
若做多管的PCR,可先加一起,再用枪分取
比如要做n管,就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好,然后再分装,如:
10xbuffer5ul
dNTP4ul
引物11ul
引物21ul
taq酶1ul
ddw34ul
模板2ul
共有9个模板,就把除模板外的其他成分乘10,即buffer50ul,dNTP40ul,引物110ul,引物210ul,taq酶10ul,ddw340ul,加到一个离心管中,加盖,用力振荡使混匀(这步是必要的,否则分到各管中的体系不均匀),稍稍离心一下,然后分装至9个PCR管中,每管48ul,再依次加入模板2ul,混匀,稍稍离心,上机
3》、保证把微量的反应物加进去
1)枪头的下端紧贴液面(不要伸进去太多),若看见有一个小水滴掉进去,证明已经加进去。不过我不赞成紧贴液面加,可能加进空气。所有的试剂都加完后,要用枪混匀,然后用手动离心机离一下,使之没有气泡,不要用手剧烈震荡tube
2)枪头不能挨到液面(加在管壁上瞬时离心),否则使某些物质的量减少,所以我们加样的时候都采取螺旋式加样的方法,也就是加样时沿着管壁螺旋式上升,等全部加完后离心混匀,如果有气泡,用手指轻轻弹几下,气泡就没了(有时ep管内有气泡,反正p时要加温,发现最后结果相差不大),而且确保液体都在管底。
3)在用单个0.2mlPCR薄壁管做反应时,加在管壁,而不是管底,在管壁形成一个小液滴,每个小液滴都孤立存在,用手弹管壁最后离心。在加大量的药品时,如果1ml枪头一下吸满了液体,在枪头提出容器时,枪头尖端可能会存留一滴液体,很容易造成污染和浪费.我的技巧是在枪头提出容器时,将枪头放平,这样枪头尖端会有一个气泡,从而阻止了液体滴的形成!
4》、避免漏加或重复加
1)事先列出清单,准备两个冰盒.将所有的试剂放在一个冰盒上。加完的转移到另一个冰盒,加样以固定的顺序加,这样不容易弄错。
2)少量加样时,可以把试剂分别先加到EP管壁,这样不仅可以确定是否加上了试剂,还可以通过目测比较各种试剂加样是否准确;
3)加样时,将所有的试剂放在冰盒上。没加的在一侧,加完的转移到另一侧。
4)将PCR试剂放在最右边的竖排,再将EP管从左边开始横排放,在每加一种试剂后一定要将EP管挪动一排,这样就可以清楚的区分哪些管加了
5)还有如没有太大影响的话,将加完的合上盖子,没加的盖子打开。
6)泡沫(软的那种)制作了个板子,把ep管放上去,在加样时用枪尖压下
5》、准确浓度:
1)试剂完全化后再加样,浓度准确。像镁离子,融化后最后用枪头再吹打完全混匀。
2)各种酶,用之前瞬时离心一下,如果买的大包装的,最好分装一下,以避免反复冻融。
3)试剂用之前瞬时离心一下.
6》、注意枪头和枪是否结合紧密,否则误差将会很大;
7》、枪头:枪头要买好的,不然你有好枪也没用。
目前各家仪器公司推出自己的数字PCR,目前市场主流的是三家,1、LIFETechnologies3D数字PCR(芯片式数字PCR):我个人认为是微孔数字PCR,主要是将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应,变成20000个反应体系,PCR反应结束后,采用CCD拍照,数阳性反应孔。2、Bio-Rad的微滴数字PCR(油包水原理):将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系,PCR反应结束后,才有流式细胞术的原理,检测每一个液体,数阳性反应的液滴数量。3、RainDance的数字PCR(油包水原理)、原理与伯乐微滴数字PCR相同,但是其液体形成能力比伯乐强很多,理论上可以产生1000万个小油滴。价格从高到底:Raindance、Bio-Rad、LIFETechnologies。目前本人使用的是Bio-RadQX200、正在做实验室,希望广数字PCR的使用者可以相互交流,相互解答疑问,更好的利用数字PCR。
试纸条:简单、快速,但对于深加工食品不适用
普通聚合酶链式反应(PCR):准确度较高,灵敏度高,价格低,缺点是专业性要求高,电泳的染料对人体有害,只能检测一个指标
实时荧光定量PCR:灵敏度高、准确度高、高通量、可实时监控,可定量判断、自动化程度高,缺点是仪器价格高昂、操作复杂、配套产品少、维护费用高
恒温荧光PCR:灵敏度高、特异性强、快速还可实时监控,仪器性价比高,利于推广
数字PCR:准确度高、重现性好、可绝对定量、检测通量高、灵敏度好,但仪器价格昂贵
水质分析
水是生命之源,清洁的环境水质是社会可持续发展的重要目标。
>水质常规指标检测解决方案
> 化学污染物指标测试
空气质量监测
生命离不开空气。保障空气质量安全,维护公共健康是政府和个人都关心的问题。赛默飞通过先进的空气质量监测技术,操作简便和性能可靠的监测仪器,高效稳定的系统,能开展气体检测和温室气体分析。
> 环境空气质量自动系统
> 大气复合污染(灰霾)监测解决方案
> 污染源烟气连续自动监测解决方案
> 汞监测解决方案
> 温室气体解决方案
> 在线环境及流程监控
> 气溶胶及气体组分在线离子色谱监测系统
辐射测量与安全
赛默飞是全球最重要的辐射测量和安全仪器供应商之一,产品应用于核电站、国土安全、军队、辐射管理部门、环保和医疗机构、应急响应等众多领域和机构。
> 便携式多功能辐射巡测系列产品
> 分布式网络辐射监测软件系统
> 长寿命放射性核素监测
土壤和固体废弃物
土壤及固体废弃物监测是环境监测中未来的重点领域。环境污染物可在土壤中长期积累,造成持久性污染。在未来几十年内城市化进程中,固体废弃物污染造成的环境污染将是多数城市都无法回避的问题。
> 欧盟环保指令-RoHS指令和无卤分析
> 持久性有机污染物分析
> 样品前处理
服务中国空气检测40年,专利EPA认证PM2.5监测产品遍布各大城市。 保障食品安全的重要手段是在食用之前,对食物从原材料、生产到出厂都经过严格的检测和管理。优异的实验室集成服务还可高效率大批量处理样本,以低成本运营,并在保证产品质量符合法规要求的基础上,提升产量和效益。
应对食品安全领域各项挑战
> 环境污染物
> 微生物检测
> 非法添加剂
> 农药、兽药残留
> 转基因
> 重金属
> 食品原产地与等级区分
> 食品重属鉴别
> 食品掺杂分析
> 危害分析与关键控制点管理
> 食品中非目标物筛查……
食品安全检测方法屡获“技术创新大奖”
食品安全快速响应中心快速响应15个食品安全危机事件。 赛默飞致力于生命科学领域的技术创新,带来更好的科学成果。
生命科学是研究生命现象、生命活动的本质、特征和发生、发展规律,以及各种生物之间和生物与环境之间相互关系的科学。
遗传分析
从金级标准的Sanger测序到简单、可扩展的Ion Torrent二代测序,优化的应用、优质的耗材以及简化的解决方案实现快速、准确且经济的结果。
基因检测与功能分析
汇集核酸分析领域的顶级品牌,包括定量PCR、数字PCR技术、克隆、反转录与基因调控产品,RNA研究领域的翘楚产品。
蛋白质功能分析
包括创新化学试剂、高效分离产品、领先色谱质谱技术,以及蛋白质组学数据处理软件,能更有信心地面对蛋白质研究的挑战。
细胞培养与分析
Ion Torrent测序仪在超过90份同行出版物被引用,是出版物中引用频率较高的台式测序。
医疗健康
研制各种专业诊断的仪器和试剂,实验室常规设备和耗材,以及各种医学研究用的先进平台与产品、
病理诊断
从常规病理检测,到数字病理分析,再到分子病理诊断。针对病理 实验室特殊环境需求及高负荷工作需求,一流的仪器设备耗材,流程设计及工作优化方案,帮助病理工作者更安全,高效地完成诊断,同 时提高诊断准确率。
感染诊断
涵盖各类型培养基、血培养系统、微生物鉴定、 药敏检测,以及降钙素原检测、PCR、qPCR、测序等系列产品,可帮助临床医生作出早期感染诊断、控制感染、指导抗生素合理使用、监测治疗和疾病 预后。
过敏诊断
过敏原自身免疫疾病诊断设备与试剂采用抗原包被技术、高特异性和高稳定性,被誉为过敏原检测的金标准。
移植诊断
通过移植前对受体/供体的组织相容性抗原(HLA)的配型、相关特异性抗体以及非HLA因素的一系列检测,为移植前 准确筛选供体、移植后有效预防抗体介导性排斥反应提供科学准确的依据,提高移植手术成功率。
转化医学研究
在转化医学领域,产品和技术广泛应用于从细胞到蛋白组学,再到基因组学的研究,加速生物标记物用于伴随诊断及个体化医疗 医药产业是一个国家国民经济的重要组成部分,与国民生命健康和生活质量等利益密切相关。
赛默飞专注制药生产的每个环节。
> 研究阶段
- 基础研究 靶标发现 药物设计
- 基因功能分析
- 蛋白质分析
- 细胞培养分析
- 化合物分析和筛选
> 技术市场化阶段
- 预临床研究 一期临床 两期临床 三期临床
- 临床前评价
- 临床试验
> 生产上市阶段
- 药物生产 药物上市 四期临床
- 大规模生产
- 过程控制
- 质检和质控
- 大规模临床试验
中医药现代化整体解决方案
中医药是中华文明长期发展中积累下的宝贵财富,其有效的实践和丰富的知识中蕴含了深厚的科学内涵。
生物仿制药解决方案
在快速发展的生物仿制药领域,用简单、可靠的解决方案,提供安全的产品,最大限度缩短上市所需时间。 除医疗、生物制药、食品安全和环境还有法医行业外,赛默飞的产品与技术也在众多工业行业得到广泛应用,服务生活及工业制造的方方面面,满足各行各业的需求。
石油化工
从石化上游的原油开采、输送、炼油和乙烯生产,到下游合成材料、精细化工、橡胶加工等完整的产业体系,解决石油化工行业各业务环节中的实际问题。
> 石油炼制 > 天然气加工
> 石油产品分析 > 精细化工
> 化石生产 > 生物柴油
> 化工产品
钢铁
从材料处理到金属加工再到最终产品监控,在线及实验室的严苛金属分析,改善工作流程,提供优异的元素分析产品和服务。
> 原料处理 > 冷轧
> 炼钢 >钢加工
> 热轧 > 中心监测站
水泥
独一无二的创新技术为整个水泥加工流程提供了综合解决方案,兼顾原材料、能耗、替代性燃料使用和添加剂优化。其中具 有可靠、耐用、紧密和高性价比的分析技术,可为从小型水泥生产厂,到大规模生产研磨站的众多客户提供服务。综合的化学和包括游离氧化钙在内的物想分析, 在线确保更优的简仓控制。
能源
科学家和工程师对前沿能源相关重要材料的化学、结构和性能间相互作用实现控制。
> 燃料电池
> 发电厂
> 太阳能
机电
伴随微电子和半导体器件制作尺寸的越来越小,使用元素和化合物种类的不断增加,由此产生了一系列复杂的材料问题,为材料工程师带来了更严峻的挑战。对于这一蓬勃发展的行业,市场上并不存在有一项能够完全满足所有相关材料分析的技术。
材料
材料科学家和工程师研究和开发先进的涂料和涂层、陶瓷和玻璃、纸张和油墨等众多材料,实现对包括塑模、文物、印刷、光学部件、汽车组件等在内应用的提升。

