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제품특징
□특징
● 목적 단백질의 발현 수준을 정밀하고 신속하게 직접 조절
● 단일 vector 시스템
● 많은 세포와 단백질에서 검증된 시스템
● 어떤 promoter와도 함께 사용 가능
□ 간편하고 효과적인 기술
ProteoTuner system은 목적 단백질을 in vivo에서도 신속하게 직접 조절 가능한 매우 독창적인 기술이다. 단백질 기능 연구를 위한 강력한 이 기술은 2 가지 핵심 요소로 구성 되어 있다.
● 12 kDa destabilizing domain (DD)이 목적 단백질과 융합 발현되면 단백질을 불안정화시켜 proteosomal degradation
과정으로유도한다. DD coding sequence는 vector의 multiple cloning site (MCS)에 인접하여 존재한다.
● Shield1은 세포막 투과성이 있는 750 Da의 작은 molecular ligand로 DD와 융합된 단백질이 분해되지 않도록 보호한다.
Shield1은 DD 융합 단백질을 안정화시켜 "protein on" 상태로 유도하여 세포 내에 단백질이 축적되도록 한다. 이 안정화는 단지 15 분~30 분 정도의 짧은 시간 안에 이루어진다 (1). 그러나 배지교환을 통해 Shield1을 배지에서 제거하면 세포 내에 축적되어 있던 DD 융합 단백질은 빠르게 분해되어 "Protein off" 상태가 된다.따라서 Shield1의 농도 조절을 통해 세포 내 목적 단백질의 안정화를 조절하여 단백질의 발현 양을 조절할 수 있으며, 단백질 발현의 on/off 과정은 가역적이며 반복적으로 조절이 가능하다.
Figure 1. Ligand-dependent, targeted and reversible protein stabilization. A small destabilization domain (DD; blue) is fused to a target protein of interest. The small membrane-permeant ligand Shield1 (red) binds to the DD and protects it from proteasomal degradation. Removal of Shield1 causes rapid degradation of the entire fusion protein. The default pathway for the systems is degradation of the fusion protein, unless Shield1 is present.
□ 다양한 분야에 적용 가능한 시스템
● 세포내 도입 방법 : ProteoTuner system은 lentivirus 용이나 retroivirus 용 그리고 일반적인 plasmid 형태로 구성되어 있으며,
transfection control로 형광단백질을 발현할 수 있는 형태와 발현할 수 없는 형태로 구성되어 있다.
● DD 서열의 융합부위를 N-말단 또는 C-말단 선택 : ProteoTuner system은 DD domain이 N-말단에 융합되거나 C-말단에
융합되는 2 가지 형태로 제공되고 있으므로 실험에 따라 적절한 DD 사용이 중요하다. DD-C (ProteonTuner C system)는 C-terminal tag로 적합하고 일반적인 DD는 N-terminal tag를 이용하는 것이 적합하다.
□ 단백질 발현 수준을 조절하면서 항체나, Chemiluminescent tag으로 관찰
● DD Monoclonal Antibody는 N-말단과 C-말단의 DD를 특이적으로 검출할 수 있다. Western blot이나
immunocytochemistry로 세포 용해 후 융합 구조를 식별하고 확인할 수 있다. Antibody는 DD-AcGFP1을 일시적으로
transfection 한 10,000 개 이하의 세포에서도 DD-tag 단백질을 검출 할 수 있을 정도로 매우 민감도가 높다.
● ProteoTuner Quantitiation System에 포함된 vector는 DD-tag (발현조절)와 ProLabel-tag (정량)를 가지고 있다.
이 vector의 multicloning site (MCS)에 목적 단백질을 발현하는 유전자를 cloning하면 N-말단에 DD coding sequence와
C-말단에 6 kDa의 ProLabel-tag가 결합된 단백질이 발현된다. DD로 조절되는 단백질의 발현 정도는 ProLabel검출
시약으로 쉽게 검출할 수 있다.
Figure 2. Easy detection of DD fusions with the DD Monoclonal Antibody. Cell lysates from HeLa cells transiently expressing either DD-AcGFP1 or AcGFP1-DD, and HEK 293 cells stably expressing DD-AcGFP1, were analyzed by Western blot using the DD Monoclonal Antibody at a 1:500 dilution. Lane 1: HeLa cells transfected with pDD-AcGFP1 (e.g., DD-N).Lane 2: Negative control (untransfected HeLa cells). Lane 3: HeLa cells transfected with pAcGFP1-DD (e.g., DD-C). Lane 4: Negative control (untransfected HEK 293 cells). Lane 5: HEK 293 cells stably expressing DD-AcGFP1.
□ 유도발현의 이중 조절
pTRE-Cycle Vector는 다수의 단백질 발현을 이중으로 조절 가능하다 (Figure 3). 우선 DD로 융합된 목적 단백질은 Tet-inducible system에 의한 전사 조절과 ProteoTuner system에 의한 단백질 분해 조절을 통하여 이중으로 발현이 조절되며, 다른 또 하나는 목적 단백질이나 형광 단백질 (mCherry 또는 ZsGreen1)은 Tet-inducible expression 만으로 발현을 조절한다.
Figure 3. pTRE-Cycle Vectors for two-tiered expression control. pTRECycle1 allows you to coexpress two proteins of interest-one with a DD tag and one without. pTRE-Cycle2 and pTRE-Cycle3 allow you to inducibly coexpress a red or green fluorescent protein along with your DD-tagged protein of interest.
□ Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
□ References
1. Banaszynski, L. A. et al. (2006) Cell 126(5):995-1004.
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一种是奥曲肽微球商品名“善龙”一种是兰瑞肽微球商品名“索马杜林”
两种药物都是纯进口产品因工艺特殊国际上至今都没有仿制品出现
国外已经有了二代长效生长抑素类似物是凝胶预充剂型的长效兰瑞肽
其工艺比微球制剂更先进了一步患者可做到像胰岛素一样进行自我注射
注射周期也比现有的28天注射间隔更长能达到56天或天的注射周期
微球的制备方法是给药途径选择和控制药物释放的关键。目前，海藻酸钠微球的制备方法主要有乳化离子交联法、微乳法、复凝聚法、锐孔凝固浴法、静电滴法，以及对上述方法的改良制法等。
1.乳化离子交联法该法系指将药物与海藻酸钠溶液混合均匀后滴加至一定的油相中搅拌，制得W/O乳剂，然后加入离子交联剂交联固化，搅拌，分离得载药微球[4]。刘善奎等[5]利用此法制备了DNA疫苗海藻酸钠微球，李国明等[6]在交联固化后，继续与壳聚糖溶液反应制备了盐酸阿米替林海藻酸钠-壳聚糖微球。Ramesh等[7]改良此法，制备了利心平海藻酸钠-甲基纤维素（MC）共混微球，研究表明，随着微球中MC量的增加，微球的吸水性降低，MC的量与微球的释药速率有一定的关系，这类微球密度较低，可以在胃环境下保留12h以上，有效地提高了利心平的生物利用度。
2.微乳法此法系将一定量的海藻酸钠、药物溶于蒸馏水中搅拌互混，在超声和高速搅拌的条件下将一定量混合液逐滴加入到油相中，形成微乳体系。再将CaCl2溶液逐滴加入到上述混合液中，继续搅拌，进行洗涤，冷冻干燥保存，即得海藻酸钠载药微球。该法多用于磁性微球的制备，以获得粒径小、均匀、靶向性强的载药磁微球。颜秋平等[8]应用该法制得具强磁响应性和缓释效果的阿霉素磁性纳米微球，研究发现此微球粒径小，分散性好，具磁靶向功能，有望成为一种优良靶向肿瘤的药物载体。苏科等[9]对此法进行了进一步改良，在已获得的阿霉素磁性微球基础上，又加入水溶性二亚胺和单抗人转蛋白进行旋转混合，分离、冷冻干燥后获得了人转铁蛋白修饰海藻酸钠载阿霉素药物纳米微球（TDA）。此外，Chuah等[10]在此基础上改进，应用甲基纤维素乳化法联合外部凝胶法制得了大小均一的海藻酸钠微球。
3.复凝聚法由于海藻酸钠为阴离子聚合物，可与阳离子聚合物用复凝聚法制备复合微球。目前常用来与海藻酸盐复凝聚成球的主要有壳聚糖，此外还常与聚赖氨酸一起制备复合微球。这样得到的微球的膜壁强度较强，适合实际应用。此法系将海藻酸钠固体用蒸馏水溶解并分散均匀，加入表面活性剂，继续搅拌形成W/O型乳液。将壳聚糖以乙酸溶解，再加入CaCl2及药物于分液漏斗中，搅拌下逐滴加入到上述W/O型乳液中。加入戊二醛固化后，加正丁醇，充分振摇后放置，离心得沉淀物，即为壳聚糖-海藻酸钠载药微球。李柱来等[11]以壳聚糖-海藻酸钠为基质材料，在乳化体系中以复凝聚法制备头孢曲松微球，该微球具有良好的溶胀和缓释性能。王津等[12]应用复凝聚法制备了出球形度好，均匀圆整，粒径小，包封率较高，稳定性较好和具明显缓释作用的布洛芬壳聚糖-海藻酸钠缓释微球。
4.锐孔凝固浴法该法系将药物加入到海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，将混合物通过注射器或微孔硅胶管滴入到CaCl2溶液中，搅拌固化，分离微球移至壳聚糖溶液中，继续搅拌交联，分离微球并用蒸馏水洗涤干燥后得载药微球。高春凤等[13]应用此法制得雷公藤多苷提取物壳聚糖-海藻酸钠缓释微球，研究表明海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、CaCl2浓度以及海藻酸钠和药物质量之比对包埋率、载药量和体外释放均有影响，而交联固化时间对包埋率和载药量有影响，对体外释放影响不明显。黄岚等[14]将阳离子-β环糊精聚合物（CP-β-CD）与胰岛素形成复合物后，制备了含有此复合物的海藻酸钠/壳聚糖微球系统，并应用于胰岛素口服系统，结果表明CP-β-CD的加入，能有效的提高胰岛素的包封率以及在模拟肠液中的释放，是一种非常有前景的胰岛素口服制剂的助剂。
5.静电滴法该法系将囊材与药液搅拌混合，搅拌条件下加进海藻酸钠溶液，在注射器推动力和电场力作用下，原料液滴入低温CaCl2溶液，
迅速固化，形成海藻酸钙凝胶微球，浸泡，清洗，真空避光室温干燥。谷继伟等[15]用此法制得粒径小于1mm的奥沙普秦壳聚糖-海藻酸钠缓释微球。
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1、该制剂为肌肉注射；
2、制备该微球过程中用到了二氯甲烷、乙醇、正庚烷、二甲基硅油。国家药典有机溶剂残留规定：二氯甲烷残留限度为0.06%；乙醇残留限度为0.5%；正庚烷残留限度0.5%；二甲基硅油药典中还为収载。目前自制微球的二氯甲烷残留约0.2%左右，正庚烷残留1.0%左右，乙醇残留0.3%左右，二甲基硅油暂未检测。很明显：二氯甲烷和正庚烷超标。后来测了一下原研制剂的有机溶剂残留：二氯甲烷残留约0.1%左右，正庚烷残留1.5%左右，乙醇残留0.2%左右。本人也制剂新手，请各位大神帮帮忙，积极发言。我这个长效缓释PLGA微球制剂中有机溶剂残留限应该定多少合适，我后期优化工艺时对上述有机残留应该控制到多少一下合适。
各位老师，在用凝集法或去溶剂法制备BSA的纳米微球，查阅相关文献，使用100mg的BSA溶于10ml的去离子水中，配成1wt%的水溶液，然后在磁力搅拌下，以1ml/min或2ml/min的速度加入乙醇40ml。在加入过程中，溶液变成乳白色，然后在加入就逐渐变清凉，但同时有沉淀出现，请问各位实验过程有啥问题啊？采取哪些措施可以避免出现沉定？另外制备纳米颗粒的过程，对BSA有具体的要求吗
