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还可以标记细胞内的某些蛋白吧

1.无Ct值出现
　　检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
　　引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
　　模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
　　模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
　　2.Ct值出现过晚(Ct>38)
　　扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
　　PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
　　PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。
　　3.标准曲线线性关系不佳
　　加样存在误差:使得标准品不呈梯度。
　　标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
　　引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。
　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高
　　4.负对照有信号
　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
　　引物浓度不佳：重庆新桥医院网上预约挂号www.cqxqyy.net适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
　　5.溶解曲线不止一个主峰
　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
　　6.扩增效率低
　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
　　反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
　　7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断?
　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
　　如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
　　8.扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?
　　参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)
　　模板的浓度太高或者降解
　　荧光染料的降解

普通的节能灯，日光灯发出的光各种波长都有，波长范围很宽。激光单色性很好，波长范围很窄，波长650nm指的是这种激光笔发出的光波长在650nm附近很窄的范围里。可见光的波长范围在390—770纳米之间。红：770—622nm；橙：622—597nm；黄：597—577nm；绿：577—492nm；蓝靛：492—455nm；紫：455—390nm。650nm应该是红光。所以是红色光的激光笔。
对不同材料来说不同，绝大多数情况下，发射波长会随着激发波长的偏移而有所偏移。 对于固态物质，主要是因为分子与其它材料形成了π建 对于量子点溶液，激发波长也会显著导致发射光谱的不同。但是不是绝对的，比如对于Alex555分子，发射波长的便宜往往就相对较小，这是由于分子内部的能带结构所决定的。 如果是单纯的回答问题，答案是：有关。

因外用杀精避孕药机理研究的需要，求助目前较新的有关精子流式细胞检测的实验资料，请各位大侠不吝赐教！

fitc荧光染料能做流失elisa不好做

最近在看文献时，看到realtime－PCR做相对定量的时候，要求目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。我现在要做一些基因的相对定量，所以有几个问题想问问主任和各位高手。
1.怎么看两个反应－即目标基因和内参基因是否具有相同的扩增效率？
2.每次PCR反应的扩增情况都有差异，多次反应的扩增效率岂不是都不一样了吗？
3.如何设计才能让相对定量更可行？
由于对定量PCR的接触不多，希望各位高手多多帮助！谢谢！

溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法。
从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA，且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。

质粒DNA纯化的试验步骤：
测量DNA溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。
每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表层）与DNA－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度大约740μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。
室温下用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000rpm离心5min， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h（VTi65 转头）、 以45 000rpm离心48h（Ti50转头）、以60 000rpm离心24h（Ti65转头）或者以60 000rpm离心24h（Ti70.1转头）。普通光照下，在梯中心可见两条DNA区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）DNA和带切口的环状质粒DNA组成：下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物，位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个DNA区高产水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个DNA区带，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使DNA达到平衡。
收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头（其斜面向上）插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封住皮下注射针头的末端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头（18号），将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。展开

我想做实时荧光定量PCR，是荧光染料法，仪器是Roche公司的，做绝对定量,想自己制备目标基因标准品,如何办.请指教.

我是定量PCR的新手，有很多问题要请教大家。
我做的病毒的普通PCR结果还可以。我现在要做该病毒的定量。用的是ICycler定量PCR仪器。有那位高手能告诉我怎样操作该仪器。
我还要重新设计目的基因片段的因物吗？如果不用重新设计，那我下一步应该为做定量PCR做哪些准备呐？还需要设计参照模板吗？
这种实验的把握性有多大？
大家有什么更好的建议吗？

带荧光的染料含不含重金属

背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中扣除背景信号。
　　什么是纯荧光校正，多长时间校正一次：
　　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。
　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。

fcm常用的荧光染料有哪些