紧急！关于realtimePCR条件如何摸索的问题？？

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2021-08-20

问题描述：

最近在看文献时，看到realtime－PCR做相对定量的时候，要求目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。我现在要做一些基因的相对定量，所以有几个问题想问问主任和各位高手。
1.怎么看两个反应－即目标基因和内参基因是否具有相同的扩增效率？
2.每次PCR反应的扩增情况都有差异，多次反应的扩增效率岂不是都不一样了吗？
3.如何设计才能让相对定量更可行？
由于对定量PCR的接触不多，希望各位高手多多帮助！谢谢！

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flower_de_luce

用户

小妹还有几个问题想请教：1、同一台荧光定量pcr仪是否即可以作探针也可以作染料的。2、探针和染料的试剂盒是否一样的。3、我要用的是探针，可不可以推荐一些价格便宜一点的试剂盒。4、我要扩增的片断是160bp，这种长度能否通过合成制定标准品。5、请问哪里可以找到如何使用纯化样品的PCR产物作标准品的方法的相关资料。

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yikk

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看了这么多，此话题的前面的内容挺不错，后面的大家的问题我大概总结一下，1.关于绝对定量，相对定量的问题绝对定量：从字面理解，目的是要知道你的基因的具体拷贝数。相对定量：要知道你的基因的相对表达量。见NucleicAcidsResearch,2001,Vol.29,No.900,文章题目：anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timert-pcr.TAKARA,有篇“COMPETITIVEPCRGUIDE”讲内参照的，可以看看。2.试剂溶解的问题，一般用去离子灭菌水即可，宝贵的样品可以按照各位主任说的没错。如果是新手本版内容从头仔细看看。3.反应体系：1）MG2+浓度肯定和普通的不一样，3.5-8不等，有文献有过详细的分析，文章我没找到，去网上找一下，用英文关键词。2）引物的浓度和探针浓度比例非常重要，仔细摸索一下，肯定可以解决，2：1～9：1不等，3）据我的实验看，体系的体积好像对实验也有影响，具体不明，4）实验具体的浓度量没个定量的，每个基因的效果也不一样，我一年前的探针，（探针没有稀释）怎么都做不好，现在拿出来做，结果很好，什么MG2+,引物，探针啊，我没有计算他们的量，随手加的。4．反应条件：正如痛并快乐着丁香园主任所说，两步法即可，如果你三步法结果可以也无妨。5．Taqman，sb区别，看一下他们的工作原理，网上很多文章，sb可以除了定量，还可以做溶解度曲线，可以看出是否有非特异扩增。www.wzw.tum.de/gene-quantification/此网站有很多关于定量PCR的文献，认真看，很好的。

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flower_de_luce

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小妹还有一个问题需要各位大虾帮忙，如何以样品制作标准曲线进行相对定量，哪里有这方面的文献，谢谢。

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