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제품특징
□ 특징
● Streamlined method : genome editing 이후, 다양한 Indel sequence 확인
● CRISPR/Cas9 뿐만 아니라 TALENs, ZFNs 이후 Indel identification에사용 가능
● Ultrafast protocol : Cell direct PCR과 In-Fusion Cloning을 조합한 빠른 프로토콜
● Complete kit : target 의 증폭, 복제, sequencing용 샘플 제작에 필요한 모든 시약 포함
□ 제품설명
Guide-it IndelIdentification Kit는 genome editing (CRISPR/Cas9,TALENs, ZFNs) 이후 얻어진Indel (Insertions and deletions)의다양성을 확인하는 데 최적화된 제품이다. 본 제품은 DNA 서열분석을 위한 target site의 amplify, clone,sequencing용 샘플 조제를 위한 모든 제품과 프로토콜을 구비하고 있어 신속하고 신뢰성 높은 결과를 얻을 수 있다. Terra PCR Direct polymerase를 사용하므로 DNA 추출, 정제 없이 crude cell lysate로부터 genomic DNA fragment를 증폭할 수 있으며, 증폭산물은 In-Fusion Cloning 방법을 이용하여 pre-linearizedpUC19에 바로 cloning 할 수 있다. 이후제품 내에 포함된 Stellar Competent Cell에transformation 이후 생성된 Colony는colony PCR 하여 target region을 증폭한 후 시퀀싱하여 Indel 서열을 분석할 수 있다 (그림 1, 그림 2).
그림1. The Guide-it Indel Identification Kit provides a complete workflow foridentifying the variety of insertions and deletions (indels) introduced bynuclease-based genome editing. The protocol uses direct PCR to amplify a genomic DNA fragment (~500 to 700 bp) containing thetarget site directly from crude cell lysates (step 1). The resulting amplifiedfragments contain a pool of edited target sites from individual cells. ThesePCR products are cloned directly into a pre-linearized pUC19 vector using theIn-Fusion cloning system (step 2).After transformation of an optimized E.coli strain, colony PCR is used to amplify the target site from the plasmid(step 3). DNA sequencing is then used to identify the different indelsgenerated at the targeted genomic site (step 4).
그림2. Identification of insertions and deletions (indels) in the CD81 gene afterCRISPR/Cas9 targeting. HeLa cells were transfectedwith plasmids encoding Cas9 and an sgRNA targeting the CD81 gene. The Guide-itIndel Identification Kit was used to prepare CD81 target sites for DNA sequenceanalysis. The sequencing data from six clones was aligned with the wild-typesequence, revealing a broad range of indels in the CD81 gene.
□ 적용
● Detecting insertions and deletions introduced in mammalian genomic DNA
● Characterizing the variety of indels that are present in a cell population after nuclease-based gene editing
□ 구성품
● Guide-it Indel Identification Components
● 110μl Terra PCR Direct Polymerase Mix
● 3x 1 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
● 400μl Extraction Buffer 1
● 40 μl ExtractionBuffer 2
● 10 μl pUC19Cloning Vector, linearized (50 ng/μl)
● 200 μl ColonyPCR Forward Primer (15 μM)
● 200 μl ColonyPCR Reverse Primer (15 μM)
● 6x 1 ml PCR-Grade Water
● In-Fusion HD Cloning Kit
● NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit
● Stellar Competent Cells
□ 보존
Guide-it Indel Identification | -20℃ |
In-Fusion HD Cloning Kit | -20℃ |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | 실온 |
Stellar Competent Cells:-70℃ | -70℃ |
그 외 구성품 | -20℃ |
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我做的是用锁式探针来检测dna模板的ram,探针80base,其中杂交区40base,引物分别为16、18base,连接酶选取的T4 ligase和Taq DNA ligase两种,分别对应恒温和变温情况下的扩增。水解体系为EXO I和Exo Ⅲ的混合体系,参考的外文文献,应该没什么问题。聚合酶用的是Bst DNA大片段聚合酶。
一开始选择的探针浓度为200pmol/L,扩增效果挺好,当时用的DNA模板是质粒阳性标准品,但是后来在做敏感性的时候发现条带梯度差异几乎没有,而且阴性也出带,后来就没法做敏感性和特异性验证了,实验停滞了2个月一直也没进展。
按理说RAM借助锁式探针扩增的独特方式以及水解体系的存在可以有效防止污染才对,希望大家给点建议该如何解决。
万分感谢!!!!!!!!!!
附一张以前做敏感性的图(marker为2000的DNA ladder)以做参考
这里所说的一个碱基的差异该怎么检测?如何理解?
原理?(没有就算了...)
答的好的提高悬赏50分
有原理的追加50分
谢谢啊~~~~
同一温度下,首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝,然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100~1000个)RNA拷贝;每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;还可以加入荧光探针(分子信标),带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由实时荧光PCR仪实时捕获,直观反映扩增循环情况。
SAT检测技术的优势
→先进的恒温扩增技术
核酸扩增在一个温度下进行(42℃),无需热循环。
→领先的RNA检测技术
SAT技术直接以病原体特异性RNA为扩增靶标,以扩增产物RNA为检测靶标,在实际应用中更显优势意义。
→更高的检测灵敏度和准确性
SAT技术的扩增效率极高,15~30分钟即可将模板扩增109倍,检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术。扩增时间短,效率高。
→有效减少假阴性结果
SAT技术采用M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增,相对于其它核酸扩增技术,反应抑制物更少,有效减少假阴性结果。
→有效的解决了扩增产物的污染问题
由于扩增产物为RNA,环境中极易降解,从而大幅度提高检测结果的可靠性。
→大大降低了核酸扩增实验室的要求