实验步骤 | 细胞周期的检测(Paganoetal.2000)细胞计数1)试剂 0.25%胰蛋白酶溶液、无血清培养液。 2)设备 显微镜、计数板。 3)操作规程 (1)准备计数板:用乙醇清洁计数板和专用盖玻片,用绸布轻轻擦干。 ⑵制备细胞悬液:制备单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于IO4个/ml。如果细胞数很少,应将悬液离心,重悬浮于少量培养液中。 (3)加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液,加样量不要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡。 ⑷计数:在显微镜下,用IOx物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时,只计左侧和上方者,不计右侧和下方者。 4)注意事项 ⑴消化单层贴壁细胞,要分散良好。 (2)取样计数前,应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤其要注意这一点。镜下计数时,遇见2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如细胞团占K)%以上,说明消化不充分,或细胞数少于200个/IOmm2或多于500个/IOmm2时,说明稀 5)结果判读 一般根据计数结果能够绘制出细胞的生长曲线,从而算出倍增时间。值得注意的是,倍增时间只能反映细胞周期,但是并不等同于细胞周期。 细胞生长曲线1)原理 只有生长稳定的细胞才能绘制细胞生长曲线(司徒镇强等1996)。此处介绍用MTT法来进行生长曲线测定的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan)并沉积在细胞中,而死细胞则无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm波长测定其OD值,可以间接反映活细胞数量。在一定范围内,MTT结晶物形成的量和细胞数成正比。此方法灵敏度高、重复性好、操作简单且没有放射性污染。 2)试剂 (1)MTT溶液:称取250mgMTT,加人50mlPBS(0.01mol/L,pH7.4),磁力搅拌3〇min, 3)设备 显微镜、振荡仪、酶联免疫检测仪、96孔培养板、移濟器、吸管、离心管。 4)操作规程 (1)接种细胞、培养细胞。 (2)呈色:培养3〜5天后,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul,37℃继续孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮培养的细胞,需要离心、弃去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO,振荡lOmin,使结晶物充分溶解。 (3)比色、记录结果。以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。 5)注意事项 (1)选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前,对细胞要测定其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数时的生长曲线,然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止时不致细胞过满。这样才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。 (2)避免血清干扰。一般选择小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余的培养液。 (3)设定空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔,其他试验步骤保持一致。最后呈色时,以空白孔为零。 6)结果判读 流式细胞术原理 流式细胞仪能够分析细胞或颗粒物的各种参数,如DNA、RNA、蛋白质含量及这些物质在细胞周期中的变化。用DNA直方图可以得网细胞周期中各时相细胞的百分比及DNA含量。G0/G1期细胞的DNA含量是2n,G2/M期细胞的DNA含量是4n,S期细胞的DNA含量介于2n和4n之间。 在细胞周期中用PI单独染色无法将G0、G1期细胞分开,可以用DNA/RNA双染色将两者分开,这是因为G0期细胞不合成RNA。 流式细胞仪还能够定量细胞总蛋白、定量细胞特定功能蛋白、定量细胞内钙离子等,结合细胞周期的检测,可以观察这些物质在细胞周期中的变化 操作规程 1)制备单个细胞悬液 ⑴悬浮生长细胞。用PBS洗漆、配制成IxlO6〜2xl〇6个/ml的细胞悬液备用。 (2)单层培养的细胞。通常采用酶消化法分散细胞,制成单个细胞悬液,备用。 (3)实体组织可采用机械法、化学法、酶消化法分散组织细胞。通常是联合应用。细胞悬液用PBS洗涤,备用。 2)样品固定 ⑵乙醇法:细胞悬液离心,弃上清,用5ml4℃预冷的盐水G重悬,缓慢加入-20℃的95%乙醇15ml,使其终浓度为70%,冰浴30min。常用于Hoechst、溴化乙键、碘化丙锭(PI)、异硫氰酸荧光素等染色。 (3)丙酮法:用生理盐水悬浮细胞,加入冷丙酮,使其终浓度为85%。常用于免疫荧光染色。 盐水G的配制:葡萄糖1.lg、NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H200.39g、KH2P〇40.15g,加蒸馏水至1L。待完全溶解后,称取MgSO4JH2OL54g、CaCl2.H2O0.16g,依次溶解于上述IL盐溶液中。 3)细胞染色 这里仅介绍几种常见的染色。 a.PI15mg,枸橼酸钠O.lg,NP-400.3mI,加蒸馏水至100ml,4℃避光保存。 b.将等体积的单细胞悬液和PI染液混合,4℃放置15——20min。 c.测量前将样品用300目尼龙膜过滤。 (2)光辉霉素(MI)染色。MI只与DNA以非共价键结合。激发波长为488nm。 b.制备单细胞悬液:活细胞悬浮于含有5%——10%胎牛血清的培养液中;经70%乙醇固定的死细胞悬浮于生理盐水。细胞密度为IO5〜IO7个/ml。 c.将细胞悬液与等体积的MI染液混合,室温染15——20min。 d测量前将样品用300目尼龙膜过滤。 <3)DNA和RNA双重染色。 b.将5UMol/L的Hoechst33258染液与等体积细胞悬液混合,37℃,避光60〜90min。 c.继续加人5umol/L的PY染液,37℃静置45min。 d.IOOOg离心lmin,除去染液,用RPMI1640培养液悬浮细胞。 e.用紫外光(351〜363nm)激发Hoechst33258测定DNA,用476nm波长激发PY测定RNA。 4)注意事项 ⑴在制备样品时,离心次数不要过多,防止细胞丢失或凝集成块。 (2)消化细胞时应该注意各种不利因素,注意酶的浓度和活性。 (3)细胞固定时间不能过长。不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞固定剂。 (4)调试FCM时,应使用理想的标准品,以便获得较高的分辨率。 分离、检测处于不同时相的细胞离心淘洗法 1)原理 2)操作规程 (3)分离所需的最佳细胞数,5ml分离室为4xl〇7〜6xl07个细胞,50ml分离室为 (4)这里给出分离CHO细胞的步骤: a用冰浴冷却的含血清的完全培养基淘洗(血清含量根据细胞类型的不同来决定)。 b.调转速和流速,使细胞停留在分离室。 c.借助泵的作用加入样本,不要使标本进入气泡清除室。 d.加样后即开始收集每一个转速下洗脱出的液体,转速的增加要使各组分洗出细胞的体积稳步增加。 f.对每一流分,从体积分布以校准常数求出中位数体积。校准常数由统一大小和密度的乳胶颗粒推导出。 g.以体积中位数为基准,选择处于不同时相的细胞以备进—步研究。每一流分的均一性都用流式细胞仪来评估。 3)注意事项 M期细胞振荡脱落法 2)操作规程 药物诱导同步化——同步化在G0/G1期1)原理 血清撤离可以使细胞停滞在G0期,添加后重新进人细胞周期。 2)操作规程 (2)血清饥饿24〜48h后,细胞进人G0期样的状态 3)注意事项 ⑴首先蔚請楚雛生长細麵倍獅间雜可麵的汇合優大细胞 (2)血清撤出需要掌握最佳的撤除量及撤除时间 (3)有些细胞不适合用血清饥饿法。° 药物诱导同步化一同步化在G1期早期1)原理 Lovastatin抑制HMG-CoA还原酶,可使细胞停滞在极早的G1期。 2)试剂 用95%乙醇稀释Lovastatin到50mg/ml,溶液中加入lmol/L的NaOH调高pH,再用lmol/L的HCl中和。活化后用无菌去离子水稀释至10mm〇l/L,-20℃储存备用。 3)操作规程 (1)以最大细胞密度的30%培养细胞,培养液中加入Lovastatin。浓度依照细胞种类的不同而调整,一般是10〜60umol/L。 (2)用PBS洗2次以解除Lovastatin的作用,然后用含有甲经戊酸的培养基培养,密度是汇合密度的30%——40%。甲轻戊酸的浓度应在所用Lovastatin浓度的1〇〇倍以上。 4)注意事项 药物诱导同步化一同步化在G1期晚期1)原理 Mimosine是从植物中获得的,能将细胞阻滞在G1期晚期。 2)试剂 3)操作规程 (1)指数生长期细胞在含1〇〇〜400^imol/LMimosine的培养液终,培养16——24h。 (2)用PBS洗2次,解除Mimosine的阻滞作用,以汇合密度的30%〜40%重悬于培养液中,继续培养。 药物诱导同步化—同步化在G1/S期交界点1)原理 2)操作规程 (1)用PBS将TdR稀释,过滤除菌,-2O℃储存备用。 ⑵将指数生长期细胞用含有2mmol/LTdR的新鲜培养液培养(TG2+TM+TGl),此时细胞位于G1A期交界点和S期的任何时期。 (3)用PBS洗2次,解除TdR的抑制作用。用新鲜培养液培养一段时间(要小于tG1),使得原来处于S期末的细胞没有进入S期,原来处于G1A期交界点的细胞离开s期。 ⑷再次进行TdR抑制,l2——l4h。这时所有细胞都处于G1A期交界点。取样,用流式细胞仪评估细胞周期时相。 (5)除去二次TdR的抑制作用,释放后不同时间取样,可以获得需要的、位于不同时相的细胞,用流式细胞仪评估后,可供进一步检测。 3)注意事项 M期细胞同步化1)原理 2)注意事项 (1)由于该方法常常造成细胞的不可逆变化,所以此方法有一定争议。 (2)药物浓度、作用时间都需要摸索 |
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