目的基因在真核系统中的表达及细胞内的定位实验资讯分析测试...
| 实验方法原理 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 真核细胞 试剂、试剂盒 | HBSCaCl2TE质粒DNA 仪器、耗材 | CO2培养箱 实验步骤 | 1. 转染的前一天在35mm培养皿中植入细胞（约1×106个细胞），使得第二天转染时细胞汇合率达到50-80%； 3. 在1.5ml无菌的离心管中混合下列药品： 15.5μl2MCaCl2，最多10μg质粒DNA，补加TE(pH8.0)至125μl； 4. 在无菌的35mm平皿中加入125μl2×HBS(pH7.10)，然后逐滴加入上述混合物，一边加一边充分混合，使磷酸钙沉淀均匀，室温放置20分钟，这时溶液将有非常小的磷酸钙沉淀颗粒形成； 5. 20分钟后，将混合物加入细胞中，37℃培养箱中培养4-8小时； 6. 4-8小时后，用含血清的完全培养基替换旧培养基，37℃培养箱中继续培养； 7. 在转染后24-72小时将细胞置于荧光显微镜下观察目的蛋白的表达。 注意事项 | 1. 所有操作都必须在无菌条件下进行； 2. 2×HBS、2MCaCl2和TE须经0.22μm滤器滤菌分装后使用； 3. 沉淀的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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