琼脂糖凝胶栓中DNA的限制性内切核酸酶消化
| 实验方法原理 | 从哺乳动物细胞、酵母或细菌分离的染色体DNA在琼脂糖栓中可用所需的内切酶消化。低熔点琼脂糖栓的孔足以使内切酶进入，与作为底物的基因组DNA相作用。消化后，经PFGE分离，然后回收或做Southern印迹分析。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 限制酶基因组DNA 试剂、试剂盒 | 限制酶缓冲液TE 仪器、耗材 | 脉冲场电泳用的凝胶水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶液 1X限制酶缓冲液 TE(pH7.6) 2.酶和缓冲液 限制酶 3.凝胶 脉冲场电泳用的凝胶 4.核酸和寡核苷酸 包埋在低熔点琼脂糖栓中的基因组DNA 5.专用设备 设定在酶切最佳温度的水浴 二、方法 1.如果凝胶栓未在TE中存放（如通过邮寄收到的凝胶栓或一直存放在0.5mol/LEDTA中的），则在50倍体积TE(pH7.6)室温温育30min。转移凝胶栓至新的50倍体积TE(pH7.6)室温温育第二个30min。否则直接进行步骤2。 2.将凝胶栓移入微离心管，每管加入10倍体积相应的1X限制酶缓冲液。室温温育30min。 3.除去缓冲液，用2~3倍体积新鲜1X限制酶缓冲液替代它。每管加入20~30单位相应限制酶该酶作用的最佳温度温育；如果是YACDNA温育3h,哺乳动物DNA温育5~6h。 4.如果DNA只用一种酶消化，消化后将凝胶栓浸入4℃20倍体积的TE(pH7.6)内。1h后按步骤7处理。如果DNA用一种以上的酶消化，则跳过TE温育而进行步骤5。 5.如果DNA用一种以上的酶消化，加入第二种酶之前再次用相应缓冲液平衡凝胶栓。为了充分平衡，使用自动移液器从每管尽可能多的除去第一个酶的缓冲液，并用1mlTE替代它。除去TE,加入新鲜的1mlTE。室温存放30~60min。轻轻除去TE。 6.每管加10倍体积第二个1x限制酶缓冲液，室温温育30min。如步骤3描述的进行限制酶消化。最后，每个凝胶栓浸入4℃20倍体积的TE(pH7.6)内1h。 7.用一次性移液器吸头将凝胶栓直接轻轻推入脉冲场凝胶的加样孔（槽）中，电泳分离DNA片段。 |
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发布于 ： 2018-08-06
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