水环式真空泵/液环真空泵工作原理演示_真空技术网
| 实验方法原理 | TRIzol试剂是分离细胞和组织总RNA的即用型试剂，该试剂含有酚和硫氰酸胍单相溶液是Chomczynski和Sacchi进一步分离RNA方法的进一步改进。在匀浆或裂解样本过程屮，TRIzol试剂不仅可裂解细胞，而且可保持RNA的完整。加入氯仿后离心，溶液则分为水相和有机相，RNA绝大部分保留于水相，RNA转到水相后，用异内醇沉淀以获的RNA，移去水相后，样本中的DNA和蛋白质吋用连续沉淀获得。用乙醇沉淀吋在中间相获得DNA.异丙醇沉淀可在有机相获得蛋白质。 该技术适于在人、动物、植物、细菌少量组织（50〜l00mg)和细胞（5X104）以及大量组织（≥lg)和细胞（5X107)中分离RNA，效果很好，整个过程可在lh内完成。用TRIzol试剂分离的总RNA没冇蛋白质和DNA的污染，可用于Morrhernblot分析、斑点杂交、pdy(A)选择、体外翻译、RNase保护分析、分子克隆等。TRIzol试剂易于分离不同大小分子质量的各RNA，如从大鼠肝内分离的RNA,琼脂糖电泳后，在7kb和15kb显示出了不同的高分子质量的RNA条带，两个主要的核糖体RNA带在约5kb(28S)及约2kb(18S)处；低分子质量的RNA0.1-0.3 kb(tRNA,5SRNA) .。分离的RNA260/280=1.6〜1.8。每mg组织RNA的产置为：肝和脾，6〜10ug。肾3〜4ug，骨骼肌和脑1〜5ug，胎盘1〜4ug。从1X106个细胞获得RNA的量是：上皮细胞，8〜15ug；成纤维细胞5〜7ug。现在已冇多种TRIzol类似产品可供使用。 | ||||
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| 试剂、试剂盒 | 氯仿异丙醇乙醇无RNase的水SDS溶液TRIzol试剂 实验步骤 | 一材料与设备 1)氯仿 2)异丙醇 3)75%乙醇（用DEPC水配制） 4)无RNase的水（将水加入无RNase的玻璃瓶内，加浓度为0.1%(V/V)的DEPC过夜，尚压灭菌） 5)0.5%SDS溶液（必须DEPC处理过的高压灭菌水配制） 6)TRIzol试剂 二操作方法 1.匀浆 1)组织：每50〜l0mg组织，加入1mlTRIzol试剂，用玻璃-Teflcm或电动匀浆器勾浆。样本体积不能超过TRIzol试剂的10% 2)单层培养细胞：在3.5cm 的培养皿中加入1mlTRIzol试剂•用吸管抽吸细胞多次，直接裂解细胞。加入TRIzol试剂的量取决于培养皿的大小（1ml/10cm2）而不取决于细胞的量。TRIZol试剂的量若不足，分离的RNA易受DNA污染。 3)悬浮细胞：离心收集细胞，加入TRIzol试剂屮反复吹打裂解细胞。动物,植物,酵母每5X106～10×106个细胞用lmlTRIzol试剂。加TRIzol 试剂前请勿洗涤细胞，因为这样会增加RNA的降解。可用勻浆器裂解细荫和酵母细胞。 2.相的分离 1)匀浆后于15〜30℃放置5min，以保证核蛋白复合体完全分离。 2)加入0.2ml氯仿/lmlTRIzol试剂。盖好样本管于15〜30℃用手剧烈摇动15s，放置2〜3min。于2〜8°C小于12000g离心10mm。离心后、混合物分为三相：即最下层红色的酚-氯仿相，中间相以及上层水相&RNA绝大多数留于水相,水相体积用于匀浆的TRlzol试剂体积的60%。 3.RNA沉淀 1)将水相移至一新管（若要分离DNA或蛋白质，保留有机相），加人异丙醇，混合均匀，以沉淀RNA。每1mlTRizol试剂加入0.5ml异丙醇，于15〜30℃放置10min 2)于2〜8℃小于12000g离心10min.离心前，常看不到RNA沉淀，离心后RNA形成胶状颗粒物.沉枳在管的底部和壁上。 4.RNA洗涤 1)移去上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1mlTRIzol试剂至少加入加入1ml75% 乙醇混匀，于2〜8℃7500g 离心5min。 2)弃上清 5.RNA溶解 1)RNA沉淀空气干燥5〜l0min。勿在真空状态下离心干燥RNA，并注意勿使RNA完全干燥，因为这会大大降低其溶解性。若RNA未完全溶解，其 A260/280<1.6 2)加入不含RNase的水或0.5%SDS溶液，反复吹打以溶解RNAg如RNA较难溶解，可于55〜60℃助溶10min 注意事项 | 1)RNA产量低：其原因可能有以下几点：样本未完全匀浆或裂解；RMA沉淀未完全溶解。 2)A260/280＜1.65其原因可能有以下几点：样本太少；匀浆后，标本未室温放置水相受酚污染;RNA沉淀未完全溶解。 3)RNA降解：其原因可能有以下几点：从动物中取出的组织未立即加工或冻存；分离RNA的样本储存于-5〜一20°C,而不是一60〜一70℃：;细胞被胰酶消化；溶液或管中含有RNase;用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛PH<3.L 4)DNA污染：其原因可能有以下几点：样本太少；用于分离的样本含有机溶剂如乙醇、DMSO)虽缓冲液或碱性溶液。 5)蛋白多糖和多糖的污染：下列改进的RNA沉淀法（步骤3),可从分离的RNA中去除这些污染物。水相中每毫升TRIzolml加入0.25ml异丙醇，再加0.25ml卨盐沉淀液(0.8mol/L柠檬酸钠1.2mol/LNaCl),混合，离心，如前所述。这样可有效沉淀RNA而蛋白多糖和多糖则留在液相。 6)从少量样本(细胞≤104或组织≤10mg)中提取RMA时，加入0.8mlTRIzol试剂，匀浆后，加入氯仿，进行RNA的分离，如步骤2。用异丙醇沉淀RNA前，加入5〜10微克无RNase的糖原。 7)若样本中含有高浓度的蛋白质J旨肪.多糖或细胞外物质，肌肉、脂肪组织、植物茎块，则需进行额外的分离。匀浆后，2〜12000g离心10mm,将不溶性物质去除所得的沉淀包含有细胞外膜、多糖和髙分子质量的DNA，上清液则含有RNA。来自脂肪组织的样本，脂肪聚集在上层，可去除.将处理好的匀浆液移至新管，如上所述，加氯仿进行液相分离. 8）匀浆后加氯仿前样本可于-60〜-70℃储存至少一个月。RNA沉淀可在75%乙醇中2〜8℃放置至少一个星期，-5〜-20℃至少放置一年。 9)若在步骤2)、3)中，离心转速为2600g,时间需增加到20〜30min。 10)TRIzol试剂有毒，若与皮肤接触后，用清洗剂充分水洗。若感觉不适，应速去医院。TRIzol试剂储存于2〜8℃若室温储存，有效期为12个月。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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