材料

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。

考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录8。

1XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1xSDS凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。

L-色氨酸（10mg/ml)

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录8。

核酸和寡核苷酸

靶基因或cDNA片段

培养基

LB琼脂平板
LB培养基
根据所用载体在培养基中加入不同的抗生素。

加热到65°C的LB培养基
备选，参见步骤13。

M9基本培养基
灭菌后补加0.5%(m/V)葡葡糖，0.2%(m/V)酪蛋白酸水解物和所需抗生素，用于色氨酸诱导的表达载体。

离心机和转头

SorvallGSA转头或相当的转头

特别配备

沸水浴

设定为30°C和40°C的振荡培养器
只有使用λ噬菌体cI基因的温度敏感型等位基因时才需要。

补充试剂

本方案步骤1需要第8章方案7中所列试剂。
本方案步骤2需要第1章方案17或19中所列试剂。
本方案步骤3需要第1章方案23~26中所列试剂。
本方案步骤4需要第12章方案3中所列试剂。

载体和细菌菌株
带有λ噬菌体cI基因的cIts857等位基因或野生型等位基因的大肠杆菌菌株在M5219菌珠中是热诱导的clts857等位基因，在GI724菌珠(ATCC55151cI基因）中是色氨酸诱导的野生型cI基因。

PL表达载体（如pHUB,pPLc,pKC30,pASl,pCQV2,pAL-781和pTrxFus)

阳性对照质粒（表达已知大小融合蛋白的PL表达载体）

方法

含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建

1.PCR修饰（第8章方案7)或限制性内切酶消化分离DNA片段，片段5"端和3"端带有与PL表达载体对应的限制酶位点。
必要时可在cDNA/基因的ATG上游置入强的核糖体结合位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对PCR产物进行序列分析。

2.靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接（第1章方案17或19)。

3.连接产物转化含有cIts857等位基因或野生型cI基因的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含相应选择抗生素的LB平板（通常为50ug/ml的氨苄青霉素），于30°C(含有cIts857等位基因）或37°C(含有色氨酸诱导的野生型cI基因）过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。

4.通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第12章方案3)。

诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。

5.通过提髙温度或加入色氨酸，下调cI阻抑蛋白，诱导靶蛋白表达，筛选最佳表达条件。
影响诱导表达的因素请参见方案1步骤8的注解。

对于溫度诱导系统

a.对照菌和重组菌分别挑取1~2个菌落，接入1ml含所需抗生素的LB培养液，30°C培养过夜。
编码己知大小蛋白的表达载体作阳性对照。

b.取50ul接入10ml含抗生素的LB培养液，在50ml摇瓶中于30°C培养至对数中期（A550=0.5?1.0)。

c.吸出lml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤6和7所述进行处理。

d.调整温度至40°C,诱导剩余培养物。继续步骤6。
尽管在本书其他章节中采用42~45°C灭活λ噬菌体cIts857阻抑物，但此处采用40°C以便减少热激蛋白的诱导并使细菌能够继续生长。

对于色氨酸诱导系统

a.含空载体和重组表达载体的大肠杆菌（带有cI野生型等位基因）分别挑取1~2个菌落，接入1ml补充M9培养液，37°C培养过夜。
编码已知大小蛋白的表达载体作阳性对照。

b.取50ul接入10ml补充M9培养液，在50ml摇瓶中于37°C培养至对数中期(A₅₅₀=0.5~1.0)。

c.吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤6和7所述进行处理。

d.剩余培养物中加入色氨酸至终浓度100ug/ml,37°C继续培养。

6.诱导不同时间（如1、2、4和6h)后取1ml样品放于微量离心管中，测定A₅₅₀,室温高速离心1min。

7.沉淀悬于100ul1XSDS凝胶加样缓冲液，100°C加热3min,室温高速离心lmin，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

8.样品加热至室温，取40ug或相当于0.15OD₅₅₀培养物的悬液上样于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶。

9.8~15V/cm电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。

10.考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞，蛋白质带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。

大量表达靶蛋白

11.挑取一个重组大肠杆菌菌落接入50ml含抗生素的LB培养液或补充M9培养液,
在250ml摇瓶中于30°C或37°C过夜培养。

12.取50ml过夜培养物接入450ml含抗生素的LB培养液或补充M9培养液，在2L摇瓶中于30°C或37°C振荡培养至对数中期（A₅₅₀=0.5~1.0),按步骤13或14进行诱导。

13.加入500ml加热至65°C的13培养基，诱导带cIts857等位基因的大肠杆菌。40°C培养预试验确定的最佳时间。或者于室温以12000g(8600r/minSorvall转头）离心5min收集细胞，沉淀重悬于500ml40°C的LB培养基，40°C继续培养预试验确定的最佳时间。

14.加入色氨酸至终浓度100ug/ml,诱导带cI等位基因的大肠杆菌。37°C继续培养预试验确定的最佳时间。

15.诱导适当时间后，于4°C以5000g(5500r/minSorvallGSA转头）离心15min收集细胞，继续后面的纯化方案：

•如果表达的是GST融合蛋白，继续方案5

•如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案6

•如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案7