细胞自噬过程的观察和检测方法 实验方法
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | 自噬诱导剂自噬抑制剂单丹磺酰尸胺（MDC）0.1%SDS 仪器、耗材 | 荧光显微镜细胞爬片 实验步骤 | 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： 一、自噬诱导剂 (1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模拟内质网应激 (2)Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶） (3)Earle"s平衡盐溶液：制造饥饿 (4)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：ClassIPI3KPathway抑制剂 (5)Rapamycin：mTOR抑制剂 (6)XestosponginB/C：IP3R阻滞剂 二、自噬抑制剂 (1)3-Methyladenine（3-MA）：（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂 (2)BafilomycinA1：质子泵抑制剂 (3)Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomallumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂） 除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1、观察自噬体的形成； 2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成； 3、利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成； 4、检测长寿蛋白的批量降解； 5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色； 6、CellTrackerTMGreen染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的； 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 （注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。） |
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发布于 ： 2021-08-04
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